Повышение уровня гомоцистеина (ГЦ) в сыворотке крови признано одним из факторов риска атеросклеротического поражения сосудистой стенки [1, 2]. Гипергомоцистеинемия (ГГЦ), широко распространенная у пациентов с сахарным диабетом (СД) 2-го типа, в несколько раз увеличивает риск развития коронарной болезни сердца (КБС), инсульта и микрососудистых осложнений у этих больных [3, 4]. Фермент метилентетрагидрофолатредуктаза (МТГФР) участвует в процессах трансметилирования ГЦ и образования метионина [2]. Функциональная мутация аллеля Т677 гена МТГФР приводит к образованию термолабильного фермента, нарушению процессов метилирования ГЦ и повышению его концентрации в крови [5]. Так, в экспериментальных и клинических исследованиях было показано, что при наличии аллеля 677Т отмечается увеличение концентрации ГЦ в крови [5, 6].
Взаимосвязь полиморфизма С677Т гена МТГФР и инсулинорезистентности (ИР) в настоящее время недостаточно изучена. В популяции киргизов изучение роли данного полиморфизма в развитии СД 2-го типа и метаболического синдрома (МС) ранее не проводилось. Цель настоящего исследования: изучить ассоциацию между полиморфизмом С677Т гена МТГФР и наличием ИР у киргизов.
Материал и методы
В исследование включены 132 пациента киргизской национальности с ИР (57 женщин, 75 мужчин) в возрасте от 35 до 75 лет (средний возраст 52,3±8,1 года), из которых 74 страдали СД 2-го типа. Группу контроля составили 132 сопоставимых по полу и возрасту пациента без ИР, СД 2-го типа и МС.
Всем пациентам было проведено клиническое обследование для уточнения диагноза, включающее сбор жалоб, анамнеза, измерение систолического (САД) и диастолического (ДАД) артериального давления и антропометрических показателей: масса тела, рост, окружность талии (ОТ) и бедер (ОБ). В последующем вычисляли индекс массы тела (ИМТ) по формуле: ИМТ=масса тела (кг)/рост (м)2; отношение ОТ/ОБ. Ожирение констатировали при ИМТ≥30 кг/м2.
Кровь для определения биохимических показателей и генетического анализа брали из локтевой вены натощак после 12-часового голодания. В последующем выделяли плазму и сыворотку крови, которые замораживали в жидком азоте. В данных образцах определяли глюкозу, инсулин, общий холестерин (ОХС), триглицериды (ТГ), холестерин липопротеинов высокой плотности (ХС ЛВП) по стандартной методике. Содержание холестерина липопротеинов низкой плотности (ХС ЛНП) вычисляли по формуле Фридвальда [7]. Индекс ИР НОМА высчитывали по формуле: НОМА=(инсулин сыворотки крови (мкМЕ/мл) × глюкоза плазмы (ммоль/л))/22,5. ИР констатировали при индексе НОМА 2,77 и более. Диагноз МС устанавливали согласно модифицированным критериям AHA (2006) [8], диагноз КБС — согласно общепринятым клинико-инструментальным критериям [9].
Выделение ДНК и генетический анализ. ДНК выделяли из клеток крови с использованием набора для экстракции ДНК Nucleon BACC3 (Amersham Pharmacia Biotech, Швеция). Полиморфизм С677Т гена MTГФР определяли с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) на амплификаторе Hybaid с использованием специфических праймеров (F—TGAAGGAGAAGGTGTCТGCGGGA и R—AGGACGGTGCGGTGAGAGTG (Sigma, США) с последующей рестрикцией полученных продуктов ПЦР ферментом НinfI (Promega, США). В результате рестрикции образовывались рестрикционные фрагменты: СС 198 п.н.; ТТ 175+23 п.н., СТ 198+175+23 п.н.; их разделяли с помощью электрофореза в 3% агаровом геле. Сканирование геля и анализ полученных результатов осуществляли на имидж-денситометре Fluor-S Multimager (Bio-Rad,США).
Статистическую обработку данных проводили с помощью программы Statistica 7.0 и пакета стандартных программ PRIZM 5. Для выявления различий между дискретными переменными применяли критерий χ2. В целях оценки различий при сравнении результатов для переменных с нормальным распределением использовали t-критерий Стьюдента, а для переменных с непараметрическим распределением — тест Манна—Уитни. Статистически значимыми считали различия при р<0,05.
Результаты
Исследуемые группы не различались по возрасту и полу. Клиническая характеристика обследованных пациентов представлена в табл. 1.
Таблица 1. Сравнительная характеристика обследованных пациентов
Примечание. Здесь и в табл. 3, 4: ИР — инсулинорезистентность; АГ — артериальная гипертензия; САД — систолическое артериальное давление; ДАД — диастолическое артериальное давление; СД — сахарный диабет; ИМТ — индекс массы тела; ОТ — окружность талии; ОН — отягощенная наследственность; ССЗ — сердечно-сосудистые заболевания; ОХС — общий холестерин; ХС ЛВП — холестерин липопротеидов высокой плотности; ХС ЛНП — холестерин липопротеидов низкой плотности; ТГ — триглицериды; КБС — коронарная болезнь сердца; сн — статистически незначимо. * — данные указаны в виде абсолютного числа больных (%).
В группе пациентов с ИР чаще выявлялись артериальная гипертензия и ожирение. Соответственно уровни САД и ДАД, ИМТ и ОТ были в этой группе статистически значимо выше. Случаи курения и отягощенной наследственности по сердечно-сосудистым заболеваниям (ССЗ) у лиц с ИР и в контрольной группе встречались с одинаковой частотой. Из показателей липидного состава крови в группе с ИР по сравнению с группой контроля отмечались статистически значимое повышение уровня ТГ и снижение концентрации ХС ЛВП.
После генетического исследования было выявлено, что носительство генотипов СТ и ТТ и аллеля Т в группе с ИР встречалось статистически значимо чаще, чем в группе контроля (χ2генотип=7,22; р=0,027 и χ2аллель=7,33; р=0,0068; относительный риск — ОР 1,32 при 95% доверительном интервале — ДИ от 1,05 до 1,65; отношение шансов — ОШ 1,68 при 95% ДИ от 1,13 до 2,5) (табл. 2).
Таблица 2. Ассоциация полиморфизма С677Т гена МТГФР с ИР
Примечание. ИР — инсулинорезистентность; ДИ — доверительный интервал, ОР — относительный риск; ОШ — отношение шансов.
Кроме того, была отмечена взаимосвязь полиморфизма С677Т гена МТГФР с наличием абдоминального ожирения (χ2генотип=7,25; р=0,027 и χ2аллель=5,99; р=0,014), гипертриглицеридемией (χ2генотип=6,8; р=0,033 и χ2аллель=5,42; р=0,02) и сниженным уровнем ХС ЛВП (χ2генотип=7,31; р=0,026 и χ2аллель=7,57; р=0,006).
С целью выявления различий между генотипами все пациенты были разделены на 3 группы соответственно с наличием генотипов СС, СТ и ТТ (табл. 3). Было отмечено, что распространенность ИР и МС нарастала в группах от генотипа СС к ТТ, и различие между генотипами СС и ТТ было статистически значимым. В группе с генотипами СТ и ТТ по сравнению с носителями генотипа СС также статистически значимо чаще встречалось ожирение, в том числе превалировал абдоминальный тип с более высокими значениями ОТ и ОТ/ОБ.
Таблица 3. Факторы риска у пациентов с различными генотипами
Примечание. #— рСС—СТ <0,05; *— pCC—TT <0,05; **— pCC—TT <0,01. ИР — инсулинорезистентность; МС — метаболический синдром.
При анализе липидного состава крови было отмечено, что у носителей мутантного генотипа ТТ отмечались самые низкие уровни ХС ЛВП и наиболее высокие уровни ТГ. Различия между генотипами СС и ТТ были статистически значимыми (табл. 4).
Таблица 4. Липидный спектр и показатели углеводного обмена у пациентов с различными генотипами
Примечание. *— рСС—СТ <0,05; **— pCC—TT <0,01. Индекс НОМА=(инсулин сыворотки крови (мкМЕ/мл) ・ глюкоза плазмы (ммоль/л))/ 22,5.
Показатели углеводного обмена между исследуемыми группами статистически значимо не различались, однако следует отметить, что средний индекс НОМА у носителей генотипа ТТ превышал 2,77, в то время как в группе генотипа СС был в пределах нормы.
Обсуждение
В данном исследовании нами выявлена ассоциация между полиморфизмом С677Т гена МТГФР и ИР, а также такими компонентами МС, как абдоминальное ожирение, гипертриглицеридемия и снижение концентрации ХС ЛВП.
В предыдущих исследованиях была показана взаимосвязь между полиморфизмом С677Т гена МТГФР и повышением концентрации ГЦ в различных популяциях [10]. Данный полиморфизм приводит к аминокислотной замене аланина 222 на валин и образованию термолабильного фермента МТГФР, что сопровождается снижением его каталитической активности и нарушением связывания апобелка с кофактором ФАД. Снижение активности МТГФР приводит к нарушению метилирования ГЦ и образования метионина, что ведет к избыточному накоплению ГЦ в сыворотке крови [2]. Таким образом, мутация гена МТГФР является одним из генетических факторов риска развития ГГЦ.
Результаты исследований по изучению взаимосвязи между ГЦ и ИР носят противоречивый характер. Большинство исследователей отмечают повышение уровня ГЦ при ИР [11, 12], однако остается неясным, является гиперинсулинемия/гипергликемия фактором, повышающим концентрацию ГЦ, или, наоборот, ГГЦ приводит к развитию ИР.
Инсулин является одним из гормональных регуляторов концентрации ГЦ. В экспериментальных исследованиях была показана отрицательная взаимосвязь между уровнем инсулина и активностью цистатион-β-синтетазы — ключевого фермента в катаболизме ГЦ [13]. Таким образом, считается, что инсулин регулирует реакции транссульфурирования в печени на уровне транскрипции [14].
В клинических исследованиях было показано, что у пациентов без СД и ИР инсулин снижает концентрацию ГЦ в сыворотке крови [15]. Однако у пациентов с СД 2-го типа при развитии ИР было отмечено повышение концентрации ГЦ в сыворотке крови, несмотря на наличие гиперинсулинемии у этих больных [16]. Применение препаратов, повышающих чувствительность тканей к инсулину у крыс с ИР, приводило к снижению глюкозы и концентрации ГЦ в крови [17].
В то же время I. Terruzzi и соавт. [18] при изучении генетических факторов в развитии ожирения выявили выраженную ассоциацию между нарушением активности доноров метильных групп, активности МТГФР, метионинсинтетазы и редуктазы метионинсинтетазы с концентрацией ГЦ в сыворотке крови и наличием ожирения. Таким образом, полиморфизм С677Т МТГФР в этом исследовании являлся одним из генетических факторов развития ожирения. Взаимосвязь между ожирением и полиморфизмом С677Т гена МТГФР была подтверждена и в других исследованиях [19].
В нашем исследовании также была выявлена ассоциация полиморфизма С677Т с абдоминальной формой ожирения. Учитывая, что абдоминальное ожирение является одним из основных пусковых патогенетических факторов развития ИР, можно предполагать, что выявленная нами ассоциация между полиморфизмом С677Т гена МТГФР и ИР, а также взаимосвязь этого полиморфизма с липидными нарушениями связана с более частым развитием ожирения у носителей аллеля 677Т.
Заключение
Таким образом, носительство аллеля Т677 полиморфизма гена МТГФР ассоциируется с наличием инсулинорезистентности, абдоминального ожирения, гипертриглицеридемии и снижением уровня холестерина липопротеидов высокой плотности.
