На сегодняшний день в практике вспомогательных репродуктивных технологий бесплодные пары часто сталкиваются с проблемой многократных неудачных попыток экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). Известно, что эффективность программ ЭКО на протяжении последних 20 лет остается неизменной, не превышая 30–40% беременностей на попытку лечения, несмотря на стремительное совершенствование клинических подходов и эмбриологических методик [1].
Одной из ведущих причин многократных неудачных попыток ЭКО является остановка эмбрионов в развитии, которая в мировой литературе обозначена термином «embryo developmental arrest (EDA)» – «арест» эмбриогенеза [2]. Практика вспомогательных репродуктивных технологий отчетливо показала, что только 40% полученных эмбрионов развиваются до стадии бластоцисты; остальные эмбрионы останавливаются в развитии на разных стадиях дробления [3]. Патогенетические аспекты данного феномена до сих пор полностью не изучены. Согласно данным литературы, существует возможный вклад молекулярно-генетических факторов в нарушение развития эмбриона в период его культивирования [4].
Эмбрион, остановившийся в развитии, определяется как эмбрион, не имеющий признаков митотического деления клеток в течение как минимум 24 ч, при этом наблюдается полная дегенерация или лизис бластомеров [5].
Во время дробления эмбрион проходит несколько критических периодов развития, а именно период клеточного деления, активации генома эмбриона, компактизации до стадии морулы и формирования бластоцисты, и остановка дробления может произойти на каждом из этих этапов [6]. Дробящиеся эмбрионы также могут отставать в своем развитии, иметь различные морфологические аномалии, которые определяются во время дробления; однако в ряде случаев такие эмбрионы способны развиться до стадии бластоцисты, имплантируются и могут привести к нормально развивающейся беременности [7]. Несмотря на наличие дизморфизмов, такие эмбрионы необходимо культивировать до тех пор, пока не констатирован факт остановки его развития.
Нами был проведен поиск по электронным базам PubMed, Cochrane Library, ClinicalTrials.gov с использованием комбинации ключевых слов (embryo arrest and IVF). Было идентифицировано 314 работ, из которых 59 были отобраны для анализа влияния материнского, отцовского и эмбрионального факторов на остановку эмбрионов в развитии.
Современные подходы к тестированию эмбрионов
На сегодняшний день метод преимплантационного генетического тестирования (ПГТ) эмбрионов широко используется в практике вспомогательных репродуктивных технологий для оценки плоидности эмбрионов и, в частности, направлен на определение анеуплоидных эмбрионов, которые не рекомендованы к переносу в полость матки. Более того, анеуплоидии являются наиболее распространенной причиной прерывания беременности на ранних сроках.
Первоначальные попытки диагностировать плоидность эмбрионов осуществляли при помощи метода флюоресцентной гибридизации in situ (FISH). Биопсия осуществлялась на стадии 8 бластомеров. С течением времени технология исследования улучшалась; однако метод был ограничен тем, что на плоидность тестировалось лишь от 5 до 12 пар хромосом; при этом анализу подвергался ограниченный хромосомный участок [8]. Последующие крупные исследования и метаанализы не показали преимущества FISH перед полнохромосомными методами исследования; поэтому в настоящее время метод считается низкоэффективным [9–11]. Методом, который пришел на смену FISH, стала сравнительная геномная гибридизация (array Comparative genomic hybridization, aCGH), которая позволяет выявить микроскопические и субмикроскопические хромосомные аномалии в исследуемых образцах [12, 13]. Еще одним методом, позволяющим провести анализ всего генома, стал SNP (single nucleotide polymorphism), который дал возможность определять происхождение хромосомных нарушений – отцовское или материнское [14].
Вышеперечисленные методы являются высокоинформативными, однако реже используются в клинической практике. На сегодняшний день наиболее широкое распространение получил метод секвенирования нового поколения (Next Generation Sequencing, NGS), который обладает высокой разрешающей способностью и скоростью обработки материала, возможностью одновременно исследовать несколько десятков образцов, а также меньшей стоимостью, что является немаловажным при выборе метода исследования [15]. Использование ПГТ на анеуплоидии методом NGS необходимо для того, чтобы избежать переноса в полость матки эмбриона, который не имеет перспективы к развитию, имплантации и прогрессирующей беременности. Особое значение метод приобрел для женщин в возрасте 35 лет и старше, у которых значительная часть ооцитов являются анеуплоидными.
В работе Pirtea P. et al. (2021) имеются данные о том, что перенос эуплоидного эмбриона в полость матки заканчивается беременностью и живорождением в 65% случаев, а у женщин с нормальной толщиной эндометрия и без пороков развития матки три последовательных переноса одного эуплоидного эмбриона в полость матки заканчиваются беременностью в 95% случаев [16].
Приведенные высокие показатели требуют наличия хотя бы одного эуплоидного эмбриона, получить который не всегда удается вследствие повышения частоты анеуплоидий мейотического происхождения, что часто имеет место у женщин позднего репродуктивного возраста.
Безусловно, остановка эмбрионов в развитии является сложным процессом, этиологические и патогенетические причины которого до конца не изучены. Однако исходя из немногочисленных данных мировой литературы, можно сделать вывод о том, что одной из ведущих причин являются хромосомные генетические нарушения.
Значение материнского фактора в остановке развития эмбрионов
Ранние стадии развития эмбрионов зависят преимущественно от материнских генов, так как сразу после оплодотворения геном зиготы транскрипционно не активен. В частности, было показано, что активация материнского генома происходит в течение первых 12 ч после слияния гамет, а ранняя экспрессия отцовского генома и последующая зиготическая активация происходят на стадии 4–8 клеток у эмбрионов человека [17]. Таким образом, геном эмбриона в первые сутки культивации напрямую зависит от кодируемых материнскими генами цитоплазматических продуктов, которые синтезируются в период созревания ооцитов.
Гены, кодирующие белки ооцита и выполняющие важнейшие функции на ранних стадиях эмбриогенеза, получили название «гены материнского эффекта» (maternal effect genes, MEGs) [18]. Несколько белков, кодируемых генами материнского эффекта, вовлечены в механизмы эпигенетической регуляции, которая начинается еще в ооците и продолжается в период раннего эмбриогенеза. Таким образом, оплодотворение и ранние этапы развития эмбриона зависят от белковых продуктов генов материнского эффекта, которые находятся в цитоплазме зрелого ооцита и контролируют экспрессию генов до активации генов зиготы.
Одним из генов данной категории, роль которого в остановке развития эмбрионов обсуждается наиболее часто, является ген TUBB8 [19]. Он кодирует специфичный для приматов изотип β-тубулина, который экспрессируется на разных стадиях развития как яйцеклеток, так и эмбрионов, но при этом отсутствует у зрелых сперматозоидов. Тубулин (α/β) является структурной единицей микротрубочек. Они играют важнейшую роль в формировании веретена деления во время мейоза [20]. Поэтому патогенные изменения в структуре белка TUBB8 связаны с дефектами созревания яйцеклеток и ранней остановкой развития эмбрионов. Они нарушают функцию микротрубочек и, как следствие, приводят к нарушению формирования веретена деления во время мейоза. У женщин, имеющих патогенные генетические нарушения в данном гене, наиболее часто встречаются задержка созревания ооцитов, отсутствие оплодотворения, остановка развития эмбрионов и неудачи имплантации [19–21].
Также в числе генов материнского эффекта в литературе описаны гены CDC20, TRIP13, PATL2, BTG46, однако их влияние на развитие эмбрионов до конца не изучено. Существуют малочисленные данные о том, что ген CDC20 (cell division cycle 20) способствует переходу из стадии метафазы в анафазу в процессе клеточного деления [22]. Ген TRIP13 (thyroid hormone receptor interactor 13) имеет связь с контрольной точкой сборки веретена деления [23, 24]. Ген BTG46 (B-cell translocation gene 46) способствует деградации материнской мРНК при переходе от ооцитарного генома к эмбриональному геному [25].
В настоящее время большое внимание уделяется изучению генов так называемого субкортикального материнского комплекса (subcortical maternal complex, SCMC), локализованного в ооцитах и эмбрионах. Это мультибелковый комплекс, который состоит главным образом из 8 белков, кодируемых генами материнского происхождения и играющих ключевую роль в развитии эмбриона, а именно TLE6, NLRP2, NLRP5, NLRP7, OOEP, KHDC3L, PADI6, ZBED3 [26]. Белки данного комплекса высоко экспрессируются как в ооцитах, так и в эмбрионах на первых этапах дробления. При этом важно отметить, что разрушение и выключение функции белков SCMC начинается лишь после того, как геном эмбриона становится активным [26]. Мутации в генах, кодирующих белки SCMC, ассоциированы с дефектом созревания ооцитов, отсутствием оплодотворения, а также «арестом» раннего эмбриогенеза.
В одно из исследований, посвященных данной проблеме, были включены 118 бесплодных пар, которые имели в анамнезе две и более неудачные программы ЭКО [27]. При этом каждая попытка была неэффективной в связи с ранней остановкой развития эмбрионов по неизвестным причинам. С целью идентификации редких вариантов генов SCMC применялся метод полноэкзомного секвенирования. В результате проведенного исследования были идентифицированы редкие варианты генов OOEP и NLRP5. Было обнаружено, что две миссенс-мутации в OOEP (c.110G>C и c.109C>G) дестабилизируют белки OEP в условиях in vitro. Впервые выявлена взаимосвязь мутации в гене OOEP с «арестом» раннего эмбриогенеза [27].
Таким образом, существуют генетические факторы, связанные с нарушением репродуктивной функции. К ним в основном относятся различные хромосомные аномалии (анеуплоидии, сбалансированные и несбалансированные хромосомные перестройки, мозаицизм, в том числе различные вариации числа копий хромосом) и моногенные нарушения, которые связаны с женским бесплодием. Кроме того, есть иные факторы, влияющие на фолликулогенез и оогенез, качество яйцеклеток и компетентность эмбриона, а именно митохондриальный геном (количество копий мтДНК и мутации), различные некодирующие РНК и другие эпигенетические факторы.
Влияние отцовского фактора на остановку развития эмбрионов
У бесплодных мужчин исследование спермы основано на параметрах в соответствии с критериями Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) (концентрация, подвижность, жизнеспособность и морфология) [28]. Концентрация и подвижность сперматозоидов являются наиболее отличительными и прогностическими факторами успеха ЭКО [29]. Тем не менее можно исследовать и другие параметры спермы, в частности те, которые связаны с качеством ядер сперматозоидов (числовые аномалии хромосом, фрагментация ДНК, дефект конденсации хроматина, наличие крупных вакуолей в головке сперматозоида) [30, 31].
Геном сперматозоидов участвует в эмбриогенезе на двух разных стадиях: цитоплазматическая экспрессия, известная как «ранний отцовский эффект», и ядерная экспрессия, которая определяется как «поздний отцовский эффект». При наличии патогенных изменений в генах раннего эффекта происходит задержка пронуклеарной морфологии, делений дробления, что увеличивает степень фрагментации дробящегося эмбриона [32]. Кроме того, сперматозоиды участвуют в таких процессах, как формирование зиготы, дробление и эпигенетическая регуляция, что, в свою очередь, влияет на результаты ЭКО [33, 34].
Характеристики сперматозоидов, способные изменить развитие эмбриона, могут отличаться от тех, которые оцениваются при обычном анализе спермы [35]. Например, серьезные изменения морфологии головки сперматозоида, наблюдаемые во время интрацитоплазматической морфологически отобранной инъекции сперматозоида (ИМСИ), по-видимому, не влияют на морфокинетические параметры эмбриона [36]. Кроме того, выявлена положительная корреляция между уровнем фрагментации ДНК сперматозоидов и кинетикой развития эмбриона до стадии бластоцисты [37]. Наличие аномалий ядер сперматозоидов (например, фрагментации ДНК, дефекта конденсации хроматина) нарушало деление на два и три бластомера. Однако корреляция именно одной конкретной аномалии ядра сперматозоидов с делением эмбриона не была продемонстрирована [38].
Xin A. et al. впервые обнаружили ранее неизвестный генетический мужской фактор, ответственный за остановку раннего эмбрионального развития, выявив мутацию c.733G>A (p.Ala245Thr) в ACTL7А [39]. Данная мутация приводит к полной делеции специфического белка ACTL7А, результатом которой может являться спермиогенная задержка эмбрионального развития [40].
В исследовании 2022 г. [41] был собран в общей сложности 281 образец спермы для анализа корреляции между уровнем ACTL7A и исходами ЭКО; при этом были исключены факторы тяжелого женского бесплодия. Высокие уровни белка ACTL7A показали значимую положительную корреляцию со скоростью оплодотворения (P<0,001), процентом бластуляции эмбрионов (P<0,001) и частотой эмбрионов высокого качества (P=0,01), а также выявлена отрицательная корреляция с частотой эмбрионального ареста (P<0,001). ACTL7A потенциально может быть биомаркером для прогнозирования успешности оплодотворения, а также возможности остановки эмбрионального развития [41].
Lin Y. et al. сообщили о биаллельных мутациях в PLCZ1, хорошо известном гене, вызывающем неудачу оплодотворения, у четырех бесплодных мужчин [42]. Были идентифицированы биаллельные мутации PLCZ1, включая три новых варианта c.T1466G (p.I489S), c.1208_1213del (p.403_404del) и c.C1607T (p.W536X), которые расширили патогенный мутационный спектр гена PLCZ1. Эмбрионы от пациентов с биаллельными мутациями в PLCZ1 имели более низкий потенциал развития in vitro [42]. Кроме того, нужно отметить, что аберратные формы фосфолипазы C-дзета (PLCZ1) локализуются в акросоме сперматозоидов и приводят к неудаче оплодотворения после интрацитоплазматической инъекции сперматозоидов (ИКСИ) из-за способности индуцировать характерные колебания кальция [43]. Сообщалось, что треть бесплодных мужчин с тотальными неудачами оплодотворения (TFF) несут мутации в гене PLCZ1 [44]. В настоящее время уровень экспрессии PLCZ1 в сперме может использоваться в качестве биомаркера для прогнозирования потенциала оплодотворения после ИКСИ [45].
Неудача оплодотворения, характеризующаяся неспособностью образовывать двухпронуклеусные (2PN) зиготы с морфологически нормальными гаметами даже с помощью ИКСИ, является часто встречающимся феноменом у бесплодных мужчин, несущих биаллельные мутации в PLCZ1 [46]. Согласно предыдущим исследованиям, искусственная активация ооцитов (ИАО) может исправить отсутствие колебаний Ca2+, вызванное мутациями в PLCZ1, тем самым спасая ооциты от неудачного оплодотворения и увеличивая частоту 2PN [47]. Однако только четверть пациентов с биаллельными мутациями PLCZ1, которым производилось ИКСИ с ИАО, смогли родить собственных детей [46, 48]. Этот факт указывает на то, что PLCZ1 играет важную роль не только в оплодотворении, но и в эмбриональном развитии.
Полученные результаты могут принести пользу генетическому консультированию бесплодных мужчин в будущем и предоставить им более рациональные стратегии вспомогательных репродуктивных технологий для увеличения уровня живорождения.
Эмбриональные факторы
ЭКО позволяет изучать раннее эмбриональное развитие. Даже при значительно улучшенных условиях культивирования примерно от 10 до 15% эмбрионов ЭКО демонстрируют состояние постоянной остановки клеточного цикла, а у 40% пациентов ЭКО наблюдается по крайней мере один задержанный эмбрион за цикл [49].
Развитие человеческого эмбриона является строго контролируемым событием, и один из ключей к его регуляции может заключаться в балансе между экспрессией драйверов клеточного цикла, таких как циклины, и ингибиторов клеточного цикла, таких как ингибиторы циклинзависимой киназы. Сильная экспрессия ингибитора клеточного цикла p27 и отсутствие экспрессии циклина E в синцитиотрофобласте могут представлять собой важный механизм контроля плацентарной пролиферации человека [50]. Выявлено двукратное увеличение экспрессии ингибитора клеточного цикла циклинзависимой киназы р27 у человеческих эмбрионов на стадии дробления, демонстрирующих задержку развития, по сравнению с контрольными нормально развивающимися эмбрионами. Это первое исследование, показывающее повышенную экспрессию p27 у человеческих эмбрионов на стадии дробления, демонстрирующих задержку развития [51].
Ранние стадии человеческого развития значительно подвержены ошибкам из-за хромосомных аномалий, которые могут возникать на критических этапах мейоза, оплодотворения и ранней стадии дробления [52, 53]. Эмбрионы на стадии дробления обычно демонстрируют высокий уровень хромосомных анеуплоидий, и по статистике только 1 из 5 эмбрионов способен к имплантации [54]. На третий день развития 60% всех эмбрионов ЭКО обнаруживают по крайней мере одну анеуплоидную клетку [54]. Даже у эмбрионов пациентов моложе 35 лет, демонстрирующих лучшую морфологию и развитие, уровень анеуплоидии составляет 56% [55].
Эмбрионы человека имеют более высокие показатели анеуплоидии, чем наблюдаемые во время пренатального анализа и постнатальной жизни; следовательно, имеют место жесткий отбор и остановка развития эмбрионов с хромосомными аномалиями. Этот отбор, по-видимому, происходит в основном в предимплантационном периоде, наиболее вероятно, вследствие задержки развития или дегенерации хромосомных аномальных эмбрионов [56]. Предполагается, что задержанные и медленно делящиеся эмбрионы имеют более высокий уровень хромосомных аномалий. Эмбрионы с ускоренным дроблением также связаны с более высокой частотой хромосомных аномалий, и адекватные временные рамки являются важным фактором для оценки качества эмбриона [53].
Задержанные эмбрионы являются хорошим отражением естественного отбора анеуплоидных эмбрионов до имплантации, но 32% остановившихся в развитии эмбрионов являются эуплоидными, что доказывает многофакторность причин, влияющих на эмбриональное развитие.
Некоторые исследования показали, что еще одним фактором, играющим важную роль в раннем эмбриональном развитии, является протеинаргининметилтрансфераза (PRMT) [57, 58]. При исследовании эмбриональных стволовых клеток мышей было обнаружено, что PRMT6 необходима для поддержания плюрипотентности эмбриональных стволовых клеток. Если экспрессия PRMT6 подавляется, это приводит к сверхэкспрессии факторов дифференцировки зародышевого слоя и ускоряет дифференцировку эмбриональных стволовых клеток [55]. У мышей с дефицитом PRMT3-/-- обнаружены ранние дефекты эмбрионального развития [59]. Кроме того, Zhang W. et al. обнаружили, что мРНК и белок PRMT7 имеют значительно высокую экспрессию в эмбрионах с задержкой развития. Около 10,35% эмбрионов, остановившихся в развитии в группе с нокдауном PRMT7, были способны регенерировать до 32–64 клеток на четвертый день, что указывает на то, что подавление сверхэкспрессии PRMT7 может возобновить развитие задержанных эмбрионов [60].
В 2021 г. Sfakianoudis K. et al. опубликовали первый и единственный на данный момент систематический обзор молекулярных факторов задержки развития эмбриона, включающий 76 исследований [4]. Их данные подтверждают, что эмбриональное развитие особенно чувствительно к нарушениям экспрессии и мутациям многочисленных генов, которые контролируют пути, участвующие в регуляции клеточного цикла, репарации ДНК и созревании ооцитов. Разнообразие и гетерогенность факторов не позволяют установить причину, играющую ключевую роль в задержке развития эмбриона [4, 61]. Можно предположить, что единственной причины не существует, а есть взаимосвязанные факторы. Тем не менее для клинической практики важно понять степень генетической детерминации этих факторов и возможность или невозможность их коррекции.
Заключение
Таким образом, проанализировав данные международной литературы, можно сделать вывод, что изучение генетических факторов, влияющих на эмбриональное развитие, актуально и должно повысить осведомленность об одном из наиболее важных и сложных процессов вспомогательной репродукции. Выявление причин нарушения эмбриогенеза может помочь будущим исследованиям, направленным на разработку методик, позволяющих выбрать наиболее качественный эмбрион и оптимизировать тактику проведения программ ЭКО. Формирование гипотез и разработка новых подходов по преодолению проблемы нарушений периода раннего эмбриогенеза в конечном итоге позволит повысить процент наступления клинической беременности и живорождений.
