Введение. Аутоплазма, обогащенная тромбоцитами (АОТ), активно применяется в клинической практике уже более 15 лет [1]. Субстратом ее получения является собственная кровь пациента, которая содержит концентрат различных факторов роста и биомолекул, участвующих в процессах регенерации. Научно подтверждено, что стимулирующий эффект АОТ проявляется при количестве тромбоцитов более 1 млн в 1 мкл [2]. При активации тромбоцитов, т.е. разрушении, из α-гранул высвобождаются факторы роста, которые выполняют определенные функции: стимулируют образование коллагена, рост новых сосудов и эндотелия. При активации тромбоцитов из α-гранул высвобождаются факторы роста, которые стимулируют образование коллагена, рост новых сосудов и эндотелия. Механизм действия факторов роста основан на взаимодействии с окружающими клетками, индуцируя пролиферацию, клеточную миграцию и синтез внеклеточного матрикса.
С момента начала исследований разными группами специалистов были разработаны собственные протоколы получения АОТ, что привело к получению различных продуктов АОТ, которые содержат разные по составу и количеству факторы роста и биомолекулы [2]. Таким образом, для изучения эффективности полученного продукта АОТ необходимо определить его количественный и качественный составы.
В настоящее время перспективным и популярным направлением является применение АОТ в лечении эректильной дисфункции (ЭД). В клиническом исследовании [3] показана эффективность и безопасность АОТ, полученной по разработанному протоколу, в лечении ЭД, однако механизм действия требует патогенетического обоснования.
Также актуальным и перспективным является использование криоконсервированной АОТ.
Цель исследования: определение точного количественного и качественного состава факторов роста (PDGF-AA, PDGF-BB, VEGF, VEGF-D, FGF-acid, FGF-basic) и тромбоцитов в различных модификациях АОТ.
Материалы и методы. В качестве материала для приготовления АОТ и последующего определения концентрации факторов роста использовалась кровь 12 мужчин-добровольцев в качестве группы сравнения (контрольная группа) и 12 пациентов с жалобами на ЭД. Возраст пациентов составил 43,7±13,1 года.
У добровольцев и пациентов с жалобами на ЭД кровь забиралась в 2 стерильные вакуумные пробирки объемом 9 мл с содержанием Na3C6H5O7 3,8%.
Затем пробирки центрифугировали на лабораторной центрифуге ЕВА-20 при скорости 500 g в минуту в течение 5 мин. По окончании производили забор верхнего слоя и его перенос в вакуумные пробирки 4,5 мл для дальнейшего центрифугирования при скорости 1538 g в течение 3 мин.
Для оценки количества тромбоцитов и концентрации факторов роста в АОТ был произведен отбор проб в пробирки Эппендорфа. Содержимое разделялось на три группы по следующей схеме: пробирки Эппендорфа в 1-й группе активировали 10%-ным раствором CaCl2 в соотношении 1:10 перед каждым определением концентрации факторов роста и не замораживали. Вторая и третья группы пробирок Эппендорфа подвергались заморозке в течение 2 нед и 2 мес соответственно и не активировались.
Определение концентрации факторов роста (FGF acid, FGF basic, PDGF-AA, PDGF-BB, VEGF, VEGF-D) проводили с помощью технологии xMAP Luminex (Gen-Probe) на основе проточной цитометрии.
Результаты. Концентрация тромбоцитов в цельной крови доноров составила 207 (149–343)9/мл, у пациентов с ЭД – 246 (149–389)9/мл, т.е. была в пределах нормы. По разработанной методике получения АОТ после двух этапов центрифугирования концентрация тромбоцитов в контрольной группе достигла 1480 (1120–1644), у пациентов с ЭД – 1232 (956–1502).
После активации 10% CaCl2 приготовленной АОТ были определены и подсчитаны факторы роста: PDGF-AA, PDGF-BB, FGF-basic, FGF-acid, VEGF, VEGF-D.
В итоге в образцах контрольной группы, приготовленных без преждевременной заморозки, концентрация составила: PDGF-AA 704 (22–3900), PDGF-BB 2249 (56–4000), FGF-basic 13,8 (1,85–75), FGF-acid 2,5 (1,85–6,9), VEGF 9,9 (1,1–45), VEGF-D 21 (14–38). Аналогичное исследование было проведено в группе пациентов, страдавших ЭД: PDGF-AA 842 (22–3700), PDGF-BB 2837 (1460–4100), FGF-basic 7,9 (0,28–127), FGF-acid 3,4 (0,14–11), VEGF 19 (4,6–46), VEGF-D 21 (14–38).
После размораживания образцов второй и третьей групп было обнаружено повышение концентрации всех факторов роста: FGF-basic, PDGF-AA, PDGF-BB, VEGF, VEGF-D и FGF-acid, причем наибольшая концентрация в большинстве случаев была достигнута в образцах АОТ, размороженных через 2 мес (см. таблицу).
Обсуждение. Результаты данной работы позволяют предположить механизм восстановления эректильной функции при применении АОТ за счет действующих веществ, выявленных в препарате АОТ, т.е. FGF-basic, PDGF-AA, PDGF-BB, VEGF, VEGF-D и FGF-acid.
В настоящей работе приведены результаты исследования концентрации тромбоцитов и факторов роста в нативной аутоплазме и при различных сроках криоконсервации. Механизм действия данных факторов роста давно изучен. FGF basic регулирует пролиферацию фибробластов, стимулирует рост эндотелиацитов и как следствие – образование новых сосудов [5]. VEGF является важным компонентом в неоангиогенезе и повышении проницаемости сосудистой стенки, что в свою очередь ведет к ускорению миграции клеток и биологически активных веществ [5].
Патоморфологические и физиологические признаки воздействия факторов роста АОТ на восстановление эректильной функции также были изучены в доклинических исследованиях. D. Xie и соавт. [6] вводили рекомбинантный bFGF интракавернозно кроликам с гиперлипидемией, что вызывало повышение релаксации тел в ответ на химический стимул, так же как способность эндотелиальных клеток синтезировать NO. В другом исследовании интракавернозное введение рекомбинантного bFGF в капсуле желатина крысам с сахарным диабетом приводило к защите эректильной функции от изменений, вызванных сахарным диабетом: увеличение экспрессии VEGF, нейрональной синтазы оксида азота, что определялось в иммуноферментном анализе Elisa [6]. Системное введение bFGF вызывало улучшение гистологических результатов в кавернозных телах: увеличение количества гладкомышечных клеток и экспрессии VEGF клетками эндотелия кавернозных тел у кроликов с гиперхолистеринемией [7]. В одном из исследований АОТ вводили интракавернозно. У крыс в экспериментальной группе было отмечено увеличение количества миелиновых нервных волокон, что способствовало восстановлению эректильной функции при травме кавернозных нервов у крыс [8].
Также другой перспективной темой в данной работе стало изучение возможности криоконсервации АОТ.
В ходе исследования показано, что в результате замораживания/размораживания содержание факторов роста в АОТ выше, чем в АОТ, не подвергавшейся заморозке. Это объясняется деструкцией клеточной оболочки при экстремально низких температурах, достигающих при замораживании.
Заключение. Таким образом, результаты данного исследования позволили определить оптимальные режимы приготовления плазмоконцентрата с максимальным содержанием тромбоцитов и факторов роста. За счет большого количества факторов роста, высвобождаемых из α-гранул тромбоцитов, происходят стимуляция образования коллагена, ускорение регенерации клеток, индуцирование роста сосудов, восстановление поврежденного эндотелия. Перспективной является идея заморозки АОТ, которая может рассматриваться как безопасный и эффективный способ хранения факторов роста с последующим применением в клинической практике.
Данное научное исследование проводится при поддержке Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере по программе «УМНИК» «Разработка системы шприц-пробирки для получения аутологичной плазмы, обогащенной тромбоцитами, для клинического применения в медицине в рамках договора № 8961ГУ/2015 от 22.12.2015г.».
