Многие врожденные и приобретенные аномалии мочеполовых путей требуют хирургического вмешательства с применением сетчатых материалов. Среди них экстрофия мочевого пузыря, гипоспадия, эписпадия, задние уретральные клапаны, миеломенингоцеле, рак мочевого пузыря, стриктура мочеиспускательного канала, стрессовое недержание мочи, пролапс тазовых органов, пузырно-мочеточниковый рефлюкс и травматические повреждения мочевыводящих путей. В настоящее время на рынке доступно более 100 сетчатых изделий, для их изготовления наиболее широко используется полипропилен. Имплантации сетки часто достаточно, чтобы воссоздать основную анатомию органа, но нормальная функция обычно полностью не восстанавливается.
Хотя сетчатые материалы предназначены для укрепления тканей, было зарегистрировано много осложнений их применения. Иногда для удаления сетки требуется дополнительное обширное хирургическое вмешательство. По некоторым данным, лечение с применением сетчатого имплантата неудачно до 30% случаев или оно приводит к неблагоприятным последствиям, таким как выраженный воспалительный ответ, приводящий к сильному дискомфорту и хронической боли, развитие инфекции и эрозия сетки. Осложнения чаще развиваются именно у пациентов урологического и гинекологического профиля, когда на имплантат действует сила тяжести и часто повторяющиеся другие деформирующие воздействия. Широкое использование синтетической полипропиленовой сетки для коррекции тканевых дефектов было ограничено из-за серьезных неблагоприятных эффектов, отмеченных в предупреждениях Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (Food and Drug Administration, FDA, USFDA) за 2008 и 2011 гг. и последующих судебных исках, несколько крупных брендов были недавно выведены с рынка. Потребность в новых синтетических материалах или модификация уже существующих, более подходящих для использования, все более возрастает, поскольку исследователи и практические врачи ищут идеальный материал для ремоделирования тканей [1–5].
В связи с этим существует и все возрастает значительный интерес к разработке сеток, сконструированных с использованием аутологичных материалов, таких как мультипотентные стромальные клетки (МСК). В идеале спроектированное изделие должно восстанавливать или сохранять нормальную функцию тканевого комплекса или органа, который оно увеличивает или замещает. Предполагается, что клеточный компонент поможет регенерировать ткани реципиента, в то время как синтетическая сетчатая матрица обеспечит временные или постоянные механические свойства. Благодаря своим уникальным иммуномодулирующим свойствам МСК обладают большим потенциалом в тканевой инжинерии, поскольку они не только непосредственно участвуют в восстановлении и регенерации тканей, но и модулируют реакции организма реципиента на внедренные конструкции. Вместе с этим созданный имплантат должен быть неиммуногенным, чтобы минимизировать возможность отторжения или развития хронического гранулематозного воспаления [6–9].
Таким образом, является целесообразной модификация имплантируемых сетчатых изделий с целью уменьшения частоты и выраженности побочных реакций и осложнений, в том числе реакций инородного тела, и одним из направлений такой модификации может стать применение МСК или биологически активных материалов, содержащих МСК. С учетом терапевтического потенциала МСК ожидается, что такие конструкции станут ценным инструментом при лечении урологических патологий, требующих укрепления тканей.
В связи с вышеизложенным была поставлена цель исследования: на основании анализа данных литературы изучить влияние клеточных технологий на результаты имплантации сетчатых материалов урологическим пациентам.
Результаты адсорбции МСК на сетчатых материалах in vitro
Покрытие различных синтетических, абсорбируемых и биологических сеток МСК и фибробластами анализировали качественно и количественно. На пяти грыжевых сетках – легкий моноволоконный полипропилен (Soft Mesh), полиэстер (Parietex-TET), полилактидный композит (TIGR), тяжелый моноволоконный полипропилен (Marlex) и дермальный коллаген свиньи (Strattice) – были адгезированы три клеточные линии: дермальные фибробласты человека, фибробласты почек и МСК крыс. Фибробласты человека закрывали всю сетку в течение 3 нед., тогда как обе линии клеток крыс – за 2 нед. МСК не демонстрировали предпочтений ни к одной из сеток, но самые высокие плотности клеточных элементов были получены на Parietex и TIGR. Предпочтение субстрата объясняет значительно более низкую плотность фибробластов на TIGR, чем Parietex. Фибробласты не смогли полностью закрыть Marlex. Strattice, которая имела наименьшую площадь поверхности, генерировала сопоставимые плотности клеток с Parietex [10].
Наблюдали только слабую адгезию МСК к полипропиленовой подложке планшета в присутствии фрагмента сетчатого протеза. После культивирования МСК в присутствии сетчатого материала и аллотрансплантата отмечено относительно равномерное распределение клеток вокруг петель сетки. В результате МСК проявляют максимальный противовоспалительный эффект и способствуют регенерации ткани в месте расположения имплантата [11].
Макрофаги имеют пластический фенотип, существующий вдоль всего спектра – от M1 (классически активированный; провоспалительный) до M2 (альтернативно активированный; регуляторный, гомеостатический). Макрофаги M1 и M2 играют различные роли в ремоделировании тканей после повреждения. Имплантировали хирургические сетчатые материалы в брюшную стенку крыс. Результаты показали, что существует сильная корреляция между реакцией макрофагов на имплантированные материалы и результатами ремоделирования тканей. Увеличение числа макрофагов М2 и более высокое соотношение макрофагов М2:М1 в месте операции через 14 дней были связаны с лучшими результатами имплантации [12, 13].
Существует вероятность, что перекрестное взаимодействие между макрофагами и МСК зависит от имплантируемого материала и влияет на репаративные процессы [14]. Использование МСК улучшает результаты имплантации по сравнению с традиционными материалами и благодаря взаимодействию МСК с макрофагами, играющими основную роль в реакциях инородного тела. МСК оказывают ангиогенное, иммуномодулирующее и регенеративное влияние в тканях после внедрения биоматериала [13]. Имплантация сетки из полипропилена с МСК жировой ткани крыс Sprague Dawley под мышечный слой брюшной полости этих животных уменьшала количество макрофагов и лимфоцитов, но не всех лейкоцитов или нейтрофилов [4].
Устанавливали влияние покрытия из фибробластов или МСК на индуцированную сеткой продукцию ИЛ (интерлейкин)-1β, ИЛ-6 и VEGF (фактор роста эндотелия сосудов, vascular endothelial growth factor) макрофагами. Фрагменты сеток Parietex, SoftMesh, TIGR и Strattice размером в 1 см2 размещали на монослое фибробластов человека или МСК крысы. Три недели спустя сетки переносили в новые планшеты и культивировали с макрофагами в течение 72 ч. Культуральную среду собирали и анализировали на содержание ИЛ-1β, -6 и VEGF с использованием стандартных анализов ELISA. Сетки без клеток индуцировали повышенную продукцию всех трех цитокинов по сравнению с макрофагами, культивируемыми отдельно. Фибробласты увеличивали синтез ИЛ-6 и VEGF, но уменьшали продуцирование ИЛ-1β. За исключением группы SoftMesh, МСК значительно ослабляли высвобождение всех цитокинов до уровней, даже ниже, чем культивируемые в чистом виде макрофаги. Как гистологические исследования, так и изучение методами трансмиссионной электронной микроскопии выявили тесные взаимодействия между цитоплазматическими мембранами клеточных элементов, расположенных на сетках, и макрофагами [15].
Таким образом, МСК снижают выраженность клеточного и системного ответа на имплантацию как синтетических сеток, так и сетчатых материалов биологического происхождения in vitro. Не исключено, что применение МСК влияет на биосовместимость указанных материалов и может стать ключевым процессом в эволюции подобных изделий для урологии.
Перспективы клеточной терапии в урологической имплантологии
Фибриновый клей часто применяют для прикрепления хирургической сетки, также он считается оптимальным средством доставки МСК в ткани. Мышам после моделирования послеоперационной грыжи имплантировали сетчатые материалы с фибриновым клеем, МСК и экзосомами МСК. К 7-м суткам было найдено значительное увеличение числа противовоспалительных макрофагов М2 и цитокинов, секретируемых Th2-лимфоцитами, при использовании МСК или их экзосом. Кроме того, анализ матриксных металлопротеиназ, их тканевого ингибитора и коллагена выявил значительные различия во внеклеточном матриксе и в процессе ремоделирования. Сделано предположение, будто фиксация сеток с помощью фибринового клея с МСК или экзосомами будет иметь благоприятный эффект в лечении тканевых дефектов с точки зрения улучшения результатов, особенно модуляции воспалительных реакций в направлении менее агрессивного и прорегенерирующего профиля [16]. Необходимо обратить внимание, что даже аутологичный фибрин может стать причиной развития реакций инородного тела [17].
Оценивали биологическое и биомеханическое поведение in vivo новой сетки из полиамидного трикотажа, покрытого желатином с МСК (105 клеток/см²) эндометрия человека. Сетки с клетками или без них имплантировали подкожно крысам на 7, 30, 60 и 90 дней. Имплантированные материалы хорошо переносились животными, меченые клетки присутствовали на сетке до 14 дней после имплантации. После 7 и 90 дней имплантации образцы с клетками были, как правило, менее жесткими, чем сетки без клеток, МСК способствовали значительно большей неоваскуляризации через 7 дней и привлекали меньше макрофагов и нейтрофилов через 90 дней. МСК оказывают противовоспалительное действие и способствуют заживлению ран с ростом новых тканей и минимальным фиброзом [1, 2].
Плохая васкуляризация служит ключевым ограничением для долгосрочного приживления больших искусственных конструкций в регенеративной медицине. Биологически инертные материалы из полипропиленовых волокон не проявляют ангиогенных свойств. Однако значительная васкуляризация может быть индуцирована адгезией МСК на инородном продукте [18, 19]. Двадцати одной крысе породы Вистар моделировали дефект брюшной стенки. Для закрытия дефекта применяли различные материалы искусственного и природного происхождения с МСК и без клеток. Использование МСК усиливает ангиогенез (доказано реакцией с антителами к CD31-антигену) и снижает выраженность воспалительного ответа. Природные имплантаты с МСК имеют лучшие механические свойства, чем без клеток, но хуже, чем полипропиленовая сетка. МСК также улучшали механические и физиологические свойства децеллюляризованных материалов естественного происхождения [20].
Каркасы из композита poly(propylene fumarate) с фибрином и с предварительно культивируемыми МСК и эндотелиоцитами пупочной вены человека имплантировали подкожно мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID) на 9 дней. Плотность сосудов была значительно выше in vivo при 3-недельном культивировании клеток на матрице перед имплантацией. Иммуногистохимическая реакция с антителами против CD31-антигена человека показала прогрессивный рост сосудистых сетей с увеличением времени культивирования до операции. Эти новые сосуды были заполнены кровью мышей-реципиентов [19]. В данном случае необходимо отметить, что антитела к CD31-антигену не обладают строгой видовой специфичностью и поэтому формирование новых сосудов из трансплантированных МСК человека не является строго доказанным, но ангиогенез как эффект МСК, несомненно, имеет место, по-видимому, за счет паракринного влияния МСК.
Мезенхимальные МСК жировой ткани пациентов с послеоперационными грыжами могут избыточно продуцировать коллаген III типа, что приводит к нарушениям соотношения коллагенов III и I типов. Применение для пластики передней брюшной стенки полипропиленовой сетки в сочетании с аутотрансплантацией МСК способствует уменьшению соотношения типов коллагена III/I за счет усиления синтеза коллагена I типа и снижения продукции III типа, что положительно влияет на структуру синтезируемой in vivo соединительной ткани [21].
In vitro и in vivo тестировали способность сетчатых материалов служить в качестве каркаса для МСК и сравнивали воспалительную реакцию и характеристики коллагена на имплантированных изделиях. Сетки Surgisis (продукт из подслизистой оболочки тонкого кишечника свиньи) и Pelvitex (на основе полипропилена) показали лучший рост клеток in vitro. Эти имплантаты с МСК и без них были установлены и закреплены на мышцах брюшной стенки крыс Sprague-Dawley. Через 90 дней in vivo найдено меньшее количество нейтрофильных клеток при имплантации Pelvitex и более упорядоченное расположение и объем коллагена после внедрения Surgisis. Через 7 дней образцы Surgisis с МСК продемонстрировали более высокую жесткость и устойчивость к усилию разрушения. То есть присутствие МСК на искусственных материалах уменьшало системный воспалительный ответ на их присутствие в организме и улучшало характеристики коллагена на границе между имплантатами и нативными тканями [22].
Были протестированы три образца широко используемых биологических и синтетических сетчатых изделий: Parietex, TIGR и Strattice. Каждая сетка была покрыта фибробластами почки или МСК крысы. При подкожном применении сетки размещали поверх фасции наружной косой мышцы живота крыс. В группах с внутрибрюшинной имплантацией образцы были размещены на неповрежденной брюшине. Через 30 дней все материалы без клеточного покрытия в брюшной полости были более плотно срощены с тканями относительно подкожной имплантации. Применение клеток на синтетических образцах уменьшало врастание в ткани в брюшной полости, но увеличивало в случае подкожного размещения с минимизацией различий, зависящих от места имплантации. При использовании сеток биологического происхождения клетки почечной ткани уменьшали степень врастания образцов в ткани, а МСК, наоборот, увеличивали [23].
Оценивали свойства искусственной стромы из фибрин-агарозных гидрогелей с адсорбированными МСК и армированных коммерческими сетчатыми изделиями. Применение такого материала для коррекции дефекта тканей брюшной стенки крыс Вистар приводит к менее выраженному воспалению и меньшему фиброзу, чем в случае имплантации чистых сеток, причем большинство компонентов межклеточного матрикса были очень похожи на соответствующие ткани контрольных животных [3].
Сетку для тканевой инжинерии, изготовленную из фиброина шелка с культивируемыми МСК жировой ткани, оценивали для использования при реконструкции тазового дна женщин. Самкам крыс Sprague Dawley имплантировали полипропиленовые сетки, фиброиновые каркасы или тканевые сетки. Гистологические исследования выполнены через 4 и 12 нед. после имплантации, механическое тестирование — перед операцией и через 12 нед. после внедрения. Электронная микроскопия показала, что МСК пролиферировали и секретировали матрикс на каркасах из фиброина шелка. После имплантации образцов крысам гистологический анализ выявил лучше организованную молодую ткань в группе фиброина шелка с МСК [24].
МСК 3-й генерации, выделенные из жировой ткани кроликов, размещали на каркасы из полипропиленовой сетки и имплантировали в брюшную полость самок этого вида животных. Через 4 нед. обнаружено, что чистая полипропиленовая сетка и сетка с МСК имеют разную степень коррозии и адгезии, материал без клеток был более разрушен. Полипропилен с МСК вызывал более мягкий хронический воспалительный ответ и демонстрировал значительно более высокие показатели неоваскуляризации и пролиферации фибробластов [25].
Как дифференцированные клеточные элементы, так и мезенхимальные МСК являются привлекательным инструментом для улучшения биосовместимости и тканевой интеграции сеток в урологической практике, сводя к минимуму неблагоприятные воспалительные реакции. Даже в отсутствие иммуномодуляторного действия МСК стимулируют ангиогенез в прилегающих к сеткам тканях, что также важно для приживления инородных тел.
Неэффективность и возможные неудачи применения МСК при имплантации сетчатых изделий в урологии
Не все исследователи однозначно оценивают результаты применения клеточных технологий для имплантации различных материалов.
C.J. Dolce et al. [26] имплантировали внутрибрюшинно взрослым крысам образцы сетки из полиглактина с МСК костного мозга половозрелых крыс Льюиса. Через 2 нед. имплантаты имели <25% своей площади поверхности, адгезированной к ткани в 5 из 6 (83%) образцов, тогда как после внедрения этого материала без клеток адгезия <25% отмечена только у 1 образца из 12 (8,3%), а в 7 (58,3%) наблюдениях адгезия составляла >50% площади поверхности. Однако авторы считают, что уменьшение степени адгезии имплантированного полиглактина с тканями в результате применения МСК cлужит благоприятным признаком.
Культивировали аутологичные МСК жировой ткани крыс Вистар на биоматериалах, состоящих из внеклеточного матрикса свиньи: поперечно связанного или несшитого. Двадцати четырем крысам линии Вистар был создан стандартизированный фасциальный дефект 2×4 см, восстановленный с помощью поперечно связанных и несшитых трансплантатов, обогащенных МСК. Крыс выводили из эксперимента через 3 мес. Образцы были исследованы на прочность соединения с тканями, васкуляризацию, инвазию клеток, реакции инородного тела и на образование капсул. В обоих материалах была найдена клеточная инфильтрация и неоваскуляризация. Сравнение испытуемых групп с бесклеточным контролем не показало значительных различий в толщине капсулы, реакциях инородного тела, клеточной инфильтрации или ангиогенеза. Прочность интеграции образцов поперечно сшитого внеклеточного матрикса с МСК была выше, чем у образцов без клеток, но этот результат был статистически незначимым. У матриц с несшитыми связями адгезия к тканям была значительно выше при использовании МСК, чем в группе без клеток. Сделано заключение: размещение МСК на биологических сетках не способствует существенному повышению их васкуляризации. В материалах с поперечными связями МСК не обеспечивают повышенную прочность при имплантации, в отличие от несшитых материалов. В связи с тем что выделение и адсорбция МСК на искусственных материалах – очень сложная процедура, нет достаточных преимуществ для ее использования в клинических условиях [27].
Гистологическое исследование выявило неоваскуляризацию и миграцию клеток в образцы децеллюляризированной подслизистой оболочки тонкой кишки свиньи, имплантированные с МСК жировой ткани человека для коррекции вентральной грыжи у крыс. Однако, несмотря на то что, по данным иммуногистохимического исследования, клетки человеческого происхождения постоянно присутствовали в тканях даже через 1 мес. после операции, различия в восстановлении тканей после имплантации чистого материала и образцов с МСК не были статистически значимыми [28].
МСК пупочного канатика человека вместе с гладкомышечными клетками, полученными в результате дифференцирования этих МСК, имплантировали совместно с нерассасывающейся мягкой сеткой из пролена Gynemesh PS вместо задней стенки влагалища крысам Sprague Dawley. Фиброзное ремоделирование, воспаление, васкуляризация и регенерация тканей были оценены гистологически через 1, 4, 8 и 12 нед. Не было найдено никакой разницы в фиброзном ремоделировании и воспалительной инфильтрации между сетками с клетками и без на все сроки наблюдения. При использовании МСК совместно с миоцитами отмечена более выраженная васкуляризация через 12 нед. по сравнению с бесклеточными сетками. Но и на тот срок не было обнаружено различий в соотношении коллагенов типа I/III между всеми группами животных [29].
МСК эндометрия, адсорбированные на полиамидной вязаной сетке, сохраняли жизнеспособность до 30 дней и не оказывали влияния на интеграцию материала в эксперименте на овцах при трансвагинальной аутоимплантации. Вместе с этим жесткие сетки вызывали более сильные миофибробластные и воспалительные реакции в стенке влагалища, разрушали мышечный слой и уменьшали количество эластиновых волокон по сравнению с конструкциями с использованием МСК [5].
Аутологичные клетки-предшественники эндотелиоцитов и МСК костного мозга выделяли и культивировали in vitro, затем эти клеточные элементы располагали на нетканых биоразлагаемых сетчатых каркасах (10×20 мм) из поли-4-гидроксибутирата с покрытием из полигликолевой кислоты и культивировали в течение 5 дней в системе с ламинарным потоком жидкости. Такие имплантаты с клетками внедряли в стенку легочной артерии овец на 1–2 или 4–6 нед. Неимплантированные конструкции содержали клетки, позитивные по альфа-актину гладкомышечных клеточных элементов, отмечено раннее образование внеклеточного матрикса (прежде всего гликозаминогликанов). Через 1 нед. после имплантации на конструкциях формировались поверхностные тромбы и происходила инфильтрация макрофагами. Спустя 2 нед. были найдены гранулемы, раннее образование паннуса1, макрофаги, гигантские клетки инородных тел вокруг распадающегося полимера и ранний ангиогенез с формированием микрососудов. На 4-й неделе матрицы содержали гликозаминогликаны, коллаген и были закрыты со стороны сосудистого просвета паннусом, происходящим из клеток артерии реципиента, содержащим гладкомышечные клетки с альфа-актином и эластин в виде полосок. Деградация полимерных каркасов была почти полной с заменой материала на фиброзную ткань, содержащую жизнеспособные клетки [30]. Следует отметить, что полигидроксиалканоаты, к которым относится и гидроксибутират, не являются в полной мере биодеградируемым материалом, их применение даже без МСК сопровождается длительным и выраженным гранулематозным воспалением [31, 32].
Сразу же с широкими экспериментальными работами по изучению эффективности клеточных технологий начали появляться сообщения о низкой результативности применения МСК и даже осложнениях клеточной терапии. Такие публикации немногочисленны, но они есть и их необходимо принимать во внимание. Клинические данные на сегодняшний день не позволяют сделать убедительные и однозначные выводы об эффективности применения МСК для улучшения имплантации различных материалов, за исключением того, что технология, скорее всего, безопасна в краткосрочной перспективе.
Таким образом, несмотря на большой объем данных, посвященных изучению сетчатых материалов и возможностей их модификации с использованием МСК для имплантации пациентам с целью коррекции тканевых дефектов и поддержки органов малого таза, текущие исследования весьма неоднородны, было проведено всего несколько наблюдений на клинически значимых экспериментальных моделях, что привело к противоречивым результатам. Это затрудняет проведение сравнений между используемыми типами клеток или методологиями покрытия ими различных изделий. Также до сих пор отсутствует понимание глубоких биологических механизмов влияния МСК на реакции инородного тела. Необходимы дополнительные исследования с более длительным периодом наблюдения, чтобы определить наиболее успешные и безопасные методы и материалы для восстановления патологически измененных или утраченных тканей и перехода к клиническим испытаниям. Также еще предстоит прийти к однозначному пониманию наилучших источников МСК, способов стимуляции пролиферации, консервации и доставки этих клеток в нужные ткани организма, досконально изучить причины неэффективности и риски развития различных осложнений, особенно в отдаленные сроки. Прогресс урологической имплантологии в современных условиях безусловно будет связан с внедрением современных материалов и технологий, в том числе и с использованием МСК.
