В последние годы благодаря всесторонней оценке мужской репродуктивной функции и усовершенствованию инструментов диагностики подтверждается увеличение вклада мужского фактора в бесплодие пары [1]. Бесплодием страдают примерно 15% пар репродуктивного возраста [2]. Сложно оценить преобладание мужского фактора в бесплодии из-за снижения данных показателей [3]. Доля мужского фактора бесплодия в браке варьируется от 18,8 дo 39% [4]. Среди пациентов с бесплодием приблизительно 10–15% имеют азооспермию [1]. Азооспермия (отсутствие сперматозоидов в эякуляте) обнаруживается примерно у 1% всех мужчин и у 10–15% бесплодных мужчин [5]. Данное состояние классифицируется как обструктивная или необструктивная азооспермия [1].
Необструктивная азооспермия считается причиной мужского бесплодия, не поддающаяся медикаментозной терапии [6]. Пациенты с данной нозологией не способны иметь собственных детей и имеют только варианты применения донорской спермы или усыновления [9, 11]. Для мужчин с необструктивной азооспермией единственным способом зачатия ребенка остается тестикулярная спермоэкстракция (TESE) с интрацитоплазматической инъекцией сперматозоида (ICSI) [7]. Однако TESE-ICSI имеет ограниченный успех у мужчин с необструктивной азооспермией, так как во время 1-го цикла тестикулярной спермоэкстракции сперматозоид обнаруживается в 56% случаев, а последующая вероятность оплодотворения яйцеклетки при интрацитоплазматической инъекции сперматозоида составляет 41%, в итоге вероятность стать отцом ребенка при помощи данного метода составляет лишь 23% [8].
Достижения вспомогательных репродуктивных технологий, как экстракорпоральное оплодотворение, интрацитоплазматические инъекции сперматозоида [11], существенно изменили тактику ведения пациентов с необструктивной азооспермией. Однако при невозможности обнаружения сперматозоидов при тестикулярной спермоэкстракции на сегодняшний день не существует вариантов поддержания репродуктивного потенциала этих пациентов.
Последние достижения в биотехнологии расширили возможности лечения необструктивной азооспермии [9].
Существуют новые методы лечения, направленные на решение проблемы мужского бесплодия, такие как использование герминогенных клеток, полученных из стволовых клеток, аутотрансплантация пролиферированных сперматогониальных стволовых клеток (ССК) и инъекция мезенхимальных стволовых клеток (МСК). Во-первых, для создания искусственной спермы соматические клетки пациента трансформируются в стволовые путем индукции плюрипотентных стволовых клеток или посредством переноса ядер соматических клеток в эмбриональные стволовые клетки донора. В последующем происходит дифференциация стволовых клеток в сперматозоиды, которые могут быть использованы в качестве интратестикулярной инъекции [7]. Крысам такие искусственные сперматозоиды обеспечили появление потомства [13, 14]. Аналогичным образом удалось получить гаплоидные клетки у людей, но не было попыток использовать эти гаплоидные клетки для оплодотворения человеческих ооцитов и последующего переноса их в матку [15–20]. Во-вторых, если пациенты с необструктивной азооспермией имеют сохранившиеся ССК, аутотрансплантация пролиферированных in vitro ССК теоретически может восстановить продукцию сперматозоидов [7].
Трансплантация ССК впервые была описана Brinster и Zimmerman в 1994 г.: суспензию тестикулярных клеток фертильной крысы трансплантировали инфертильной крысе, что обеспечило восстановление фертильности и появление потомства [2]. После тестикулярной биопсии происходит пролиферация ССК in vitro и в последующем их трансплантируют в яички, где они могут мигрировать в свою нишу и продуцировать зрелые сперматозоиды. Теоретически это должно приводить к появлению сперматозоидов в эякуляте и создавать условия для естественного зачатия [7]. В результате трансплантации ССК получено потомство от крыс [21–24] и рыбок-зебра [25]. Имеются сообщения о ксенотрансплантации взращенных in vitro пролиферировавших человеческих ССК крысам, но не было попыток произвести аутотрансплантацию ССК у людей [26, 27].
Третий метод – это трансплантация МСК для индукции сперматогенеза. Терапия МСК была признана новой опцией лечения бесплодия [28]. Мезенхимальные стволовые клетки вовлечены в такие процессы, как выживаемость клеток, пролиферация, миграция, ангиогенез и иммунная модуляция. В связи с этим данные клетки предложены как идеальный материал для регенеративной медицины. Их можно получить из различных тканей – костного мозга (КМ–МСК), легких, печени, жировой клетчатки (ЖК–МСК), пуповинной крови (ПК–МСК), амниотической жидкости и периферической крови. Некоторые исследования указывают на то, что в яичках и яичниках существуют очень маленькие эмбрионические стволовые клетки, которые продемонстрировали очень схожие с МСК характеристики [29]. Эти клетки находятся в базальном слое эпителия извитых канальцев яичек или в поверхностном эпителии яичников, они могут асимметрично делиться и давать рост клеткам-предшественницам. Данные клетки выживают после воздействия химиотерапии и могут запустить дифференциацию герминогенных клеток. Из этого следует, что они служат резервным хранилищем популяции стволовых клеток [30]. Вероятно, взаимодействие между этими клетками и трансплантированными МСК играет роль в восстановлении фертильности. Было заявлено, что определенная комбинация факторов роста может быть использована для индукции дифференциации МСК в клетки герминогенного эпителия [31, 32]. K. Nayernia et al. [14, 33] впервые продемонстрировали, что КM–MСК крыс могут дифференцироваться в мужские герминогенные клетки. T. Yazawa et al. [34] доказали, что МСК способны дифференцироваться в стероидогенные клетки, такие как клетки Лейдига, в условиях in vivo и in vitro [35]. Более того, показано, что КМ–МСК, трансплантированные в яички крыс с бусульфан-индуцированной азооспермией, способствовали дифференциации в клетки Лейдига и клетки Сертоли [36]. Amidi et al. [37] также продемонстрировали, что у ПК–МСК в присутствии ретиноидной кислоты появлялась способность дифференцироваться в клетки, подобные герминогенным. В другом исследовании [38] МСК, полученные из периваскулярных клеток пуповины человека, были способны дифференцироваться в клетки, подобные герминогенным, при использовании коктейля факторов роста, содержащих ретиноидную кислоту, фактор, ингибирующий лейкоз (LIF), глиальный нейротрофический фактор (GDNF), путресцин, тестостерон и фоликулстимулирующий гормон (ФСГ). Метод флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) также показал, что 10–30% клеток дали рост гаплоидным клеткам. Результаты, полученные в экспрессионном анализе, продемонстрировали, что эти клетки могут давать подобные себе клетки в клетках Сертоли при схожих условиях [38]. Эти наблюдения позволили предположить, что функционирование похожих сигнальных путей способствует развитию герминогенных клеток и клеток Сертоли. H. Asgari et al. обнаружили, что факторы, секретируемые клетками Сертоли, могут приводить к дифференциации МСК в первичные герминогенные клетки (PGCs) [39]. Эта модель экспрессии и морфологии МСК, культивируемая с клетками Сертоли совместно, была схожей с герминогенными клетками, подтверждая их дифференциацию в мужские клетки [40].
Опубликованы результаты доклинических испытаний, которые продемонстрировали, что посредством трансплантации МСК можно восстановить фертильность. В 2012 г. Sabbaghi et al. [41] трансплантировали КМ–МСК в яички крысам с азооспермией, смоделированной путем перекрута яичка. Однако экспрессия маркеров герминогенного эпителия показала дифференцировку в герминогенные клетки [41]. Трансплантация МСК в извитые канальцы крыс с бусульфан-индуцированной азооспермией могла восстановить сперматогенез [42–44]. Трансплантация КМ–МСК улучшает экспрессию маркеров герминогенных клеток в яичках и может быть предложена как подходящий метод лечения бесплодия. По мнению ряда ученых [45], увеличение экспрессии маркеров герминогенных клеток в яичках после трансплантации КМ–МСК дает основание рекомендовать данный метод для лечения мужского бесплодия [45]. Более того, МСК могут участвовать в подавлении антиспермальных антител (АSА) [46] и могут снижать факторы, приводящие к бесплодию, вызванному перекрутом яичка, через уменьшение апоптоза и оксидативного стресса, а также за счет увеличения выработки тестостерона [47]. Ghasemzadeh-Hasankolaei et al. [48] трансплантировали КМ–МСК в яички бесплодных крыс и наблюдали их дифференциацию в сперматогонии [48].
В другом исследовании [49] продемонстрирована более улучшенная способность МСК к дифференциации, это может приводить к восстановлению способности яичек к сперматогенезу по сравнению с гемопоэтическими стволовыми клетками [49]. Они обнаружили существенное повышение уровня мРНК трех генов, связанных с мейозом, через 6 нед. после инъекции стволовых клеток пуповинной крови. Метод введения инъекций был отнесен к дифференциации МСК в сперматогонии и другие клетки, поддерживающие сперматогенез, за счет повышения регуляции экспрессии генов сперматогенеза [49]. Фертильность мужских особей крыс с бусульфаниндуцированной азооспермией была восстановлена путем трансплантации ЖК–МСК [44]. Клетки, имеющие зеленофлуоресцирующий протеин на поверхности в качестве маркера, были обнаружены с обеих сторон: снаружи базальной мембраны и внутри извитых канальцев. Это подтверждает идею о том, что МСК могут участвовать в сперматогенезе двумя путями: дифференцируясь в сперматозоиды и поддерживая сперматогониальные стволовые клетки (SSCs) [44]. Другой эксперимент показал, что трансплантация ПК–МСК служит эффективным методом увеличения экспрессии герминогенных стволовых клеток у бусульфаниндуцированных моделей [50]. Дифференциация ЖК–МСК в тестикулярные герминогенные клетки в новой нише служит свидетельством того, что клеточная терапия может помочь устранить патологические изменения в извитых канальцах. Мезенхимальные стволовые клетки, полученные из жировой ткани, воссоздают микроокружение извитых канальцев посредством продукции зародышевых клеток в семенных канальцах реципиента [51]. M. Monsefi et al. [52] показали, что трансплантированные ЖК–МСК могут дифференцироваться в герминогенные клетки в извитых канальцах крыс Wistar [52]. Установлено, что оба вида МСК (из костномозговой и жировой ткани) эффективны при лечении азооспермии на животных моделях. Однако с клинической точки зрения костный мозг может быть получен только в ограниченных количествах, а жировая ткань обычно гораздо доступнее. Инициировать сперматогенез путем введения КМ–МСК удалось и морским свинкам с бусульфан-индуцированной азооспермией [53]. Аллотрансплантированные ЖК–МСК могли дифференцироваться в клетки, подобные сперматогенному эпителию, in vitro, что создает теоретическую и экспериментальную основу клиническому применению ЖК–МСК в лечении бесплодия у морских свинок с азооспермией [54]. У крыс КМ–МСК смягчают токсическое воздействие цисплатина на яички на обоих уровнях, как на молекулярном, так и на генетическом [55].
В настоящее время рассматриваются три возможных механизма восстановления тестикулярной функции во время процесса тканевой регенерации, реализуемой с помощью МСК [56]:
- они могут дифференцироваться в таргентные клетки [57];
- трансплантированные клетки секретируют факторы роста, стимулируя восстановление клеточной функции реципиента [58];
- МСК соединяются с эндогенными клетками, восстанавливая функцию поврежденных клеток [59].
Более того, клетки Сертоли иммунотолерантны [60] и это, возможно, способствует выживанию донорских КМ–МСК, защите трансплантированных аллогенных клеток от посттрансплантационной иммунной или воспалительной реакции. Недавно H. Chen et al. показали, что дифференциация спермы возможна после трансплантации ПК–МСК в извитые канальцы яичек крыс с иммунодефицитом [61].
На сегодняшний день опубликовано очень мало результатов клинических исследований с применением МСК для лечения бесплодия. В 2016 г. исследователи Иордании представили данные наблюдения за пациентами, которым интратестикулярно были введены клетки CD34+/CD133+. Пациентов наблюдали в течение 5 лет после трансплантации. Не отмечено ни одного осложнения. У 9 (33%) из 27 пациентов при гистологическом исследовании были обнаружены изменения. В 7% случаев подтверждали развитие сперматид в яичках, в 11% выявлялись зрелые сперматозоиды в спермограмме. Сперматоциты и сперматозоиды появились в семенной жидкости в нескольких других случаях после трансплантации стволовых клеток (26%). Результатами долгосрочных наблюдений были 6 естественных зачатий, 2 рождения и 1 успешно выполненное ЭКО трем семейным парам [62]. В другом исследовании 6 пациентам с необструктивной азооспермией с отрицательным результатом микрохирургической экстракции сперматозоидов, уровнями фолликулстимулирующего гормона >25 mlU/ml (норма – 1,4–13,6 мЕ/л) и ингибина B<16 (норма – 148–365 нг/мл) была произведена интратестикулярная инъекция аутологичных МСК. Все пациенты продемонстрировали положительный гормональный ответ по результатам анализа на гормоны. На фоне лечения концентрация ФСГ снизилась до 16,3±5,6 mlU/ml, а содержание ингибина В увеличилось до 14,5 нг/мл. Герминогенные клетки были обнаружены при микро-TESE у трех пациентов. Сообщалось о беременности в двух парах: в одном случае произошел аборт на 12-й неделе, в другом имело место нормальное течение беременности до 7 мес. [63].
Представленные данные литературы свидетельствуют об огромном потенциале применения МСК для восстановления фертильности у пациентов с необструктивной азооспермией. Освоение и успешное применение данного метода в клинической практике могут помочь определенной категории пациентов восстановить сперматогенез и познать радость отцовства. Однако прежде необходимо многократно подтвердить безопасность данного метода на моделях различных животных и лишь потом в случае успеха начинать исследования на добровольцах.
