Рак мочевого пузыря (РМП) – актуальная проблема современной онкоурологии. В мире показатель заболеваемости РМП составляет 9,0 и 2,2 случая на 100 тыс. среди мужчин и женщин соответственно [1]. В Европе соответствующие показатели составляют 19,1 и 4,0 случая на 100 тыс. населения [2]. В Российской Федерации за последние 10 лет наблюдается увеличение заболеваемости РМП с 46 до 69 случаев на 100 тыс. населения; количество новых случаев РМП выросло на 34,8% у мужчин и на 14,4% у женщин [3]. Показатели заболеваемости и смертности от РМП широко варьируются в разных странах вследствие различий в факторах риска, особенностей выявления, диагностики и доступности лечения [4].
Данные мировой статистики свидетельствуют о том, что в структуре РМП у 75% пациентов превалирует ограничение опухолевого процесса слизистой или подслизистой оболочкой (стадия Та, карцинома in situ и стадия Т1); у больных молодого возраста (≤40 лет) этот показатель еще выше [5].
В Российской Федерации за 2006–2016 гг. также наблюдалось увеличение удельного веса больных более ранней стадией РМП (I–II) – с 57,4 до 74,2%, что свидетельствует об улучшении качества диагностики опухолевого процесса. Напротив, доля больных РМП поздних стадий (III и IV) за указанный временной период прогрессивно снижалась – с 26,8 до 13,4% и с 11,4 до 9,7% соответственно, что определяет закономерное снижение смертности от РМП с 23,1 до 16,6% [3]. В связи с этим поиск и внедрение новых инновационных методов ранней диагностики РМП представляют собой несомненную научную и практическую значимость.
К методам выбора и «золотому» стандарту в диагностике первичного и рецидивного РМП относятся цистоскопия и цитологическое исследование мочи (ЦИМ) [6]. Однако эти методы имеют определенные ограничения. Так, при выполнении традиционной цистоскопии небольшие папиллярные опухоли или карцинома in situ могут быть пропущены. Дифференциальная диагностика между воспалительными изменениями слизистой мочевого пузыря и карциномой in situ может быть затруднена из-за эндоскопической картины очаговой гиперемии слизистой мочевого пузыря [7]. Тем не менее, согласно клиническим рекомендациям Европейской ассоциации урологов, при подозрении на РМП цистоскопию нельзя заменить ЦИМ или какими-либо другими неинвазивными исследованиями. Считается, что ЦИМ имеет высокую чувствительность к выявлению опухолей высокой степени злокачественности (84%), но низкую чувствительность при опухолях низкой степени злокачественности (16%) [2, 8]. Чувствительность ЦИМ в диагностике карциномы in situ составляет 28–100% [9].
В алгоритм проводимых исследований пациентов с подозрением на РМП также включают компьютерную томографию [7, 10, 11], экскреторную урографию [12, 13], трансабдоминальное и трансректальное УЗИ [14], фотодинамическую диагностику [15,16], трансуретральную резекцию [17, 18] и биопсию опухолей мочевого пузыря [19, 20] с последующим морфологическим исследованием биологического материала [21, 22]. Однако эти высокоспецифичные и чувствительные технологии инвазивны, дорогостоящи и требуют тщательной подготовки, а также выполнения высококвалифицированными специалистами. По этой причине в последние десятилетия в диагностике РМП возрастает роль неинвазивных методов, работающих на молекулярном, клеточном и генетическом уровнях.
В настоящее время в мире идут поиски идеальных генетических и биологических маркеров РМП. Однако ни один из них не принят в качестве стандартного, рекомендуемого современными протоколами и нормативными документами.
В патогенезе РМП ключевую роль играют точковые мутации в онкогенах и генах-супрессорах, которые представляют собой наиболее распространенное молекулярно-генетическое событие канцерогенеза [23]. Риск развития РМП повышен относительно среднепопуляционного уровня у носителей неблагоприятного сочетания аллелей генов первой и второй фаз биотрансформации ксенобиотиков, что способствует более активному накоплению мутаций под действием экзо- и эндогенных мутагенов [24]. В редких случаях РМП связан с герминальными мутациями и может быть частью клинической картины наследственного онкологического синдрома [25].
В настоящее время для неинвазивной лабораторной диагностики РМП применяют рутинный цитологический анализ мочи, иммуноферментный анализ на UBC-антиген (цитокератины 8 и 18), ВТА-тест или определение NMP22 [21].
Первой тест-системой, способной выявлять генетические нарушения в опухолевых клетках из осадка мочи, стала Uro Vysion («Abbot Molecular», США). Метод основан на FISH-анализе осадка мочи для выявления анеуплоидии хромосом 3, 7, 17 и потери локуса 9р21. Тест Uro Vysion одобрен FDA и рекомендован в качестве диагностического теста для пациентов с гематурией при подозрении на РМП. К ограничениям Uro Vysion относят необходимость валидации результатов теста вторым специалистом при пограничном уровне хромосомных аберраций, некорректность его результатов при бактериурии, недостаточное для анализа количество атипических клеток в осадке мочи при опухоли размером менее 5 мм, возможность ложноположительного результата у пациентов с опухолями мочеполовой системы других локализаций, также несущими множественные хромосомные аберрации. Клиническая чувствительность и специфичность Uro Vysion составляют 71 и 66% соответственно [26].
Внимание ряда исследователей сосредоточено на поиске точковых мутаций, которые встречаются в онкогенах на стадии инициации РМП. Среди них выделяют однонуклеотидные замены, которые встречаются с диагностически значимой частотой (более 5%) в первичных опухолях и могут быть выявлены рутинными молекулярно-генетическими методами, что позволяет рассматривать их как потенциальные маркеры РМП. Это активирующие миссенс-мутации в 7-м и 10-м экзонах гена рецептора фактора роста фибробластов 3 (FG-FR3), 9-м и 20-м экзонах гена фосфатидилинозитол-4,5-бифосфат-3-киназы (PIK3CA) [27, 28].
Другие исследователи считают, что применение тест-систем для выявления мутаций FGFR3 методом ПЦР в режиме реального времени или ПЦР с последующим мини-секвенированием дают возможность более эффективно использовать анализ соматических мутаций в диагностике РМП [29, 30].
Анализ мутаций FGFR3 может быть дополнен определением генов, которые часто и с высокой специфичностью подвергаются аберрантному гиперметилированию при РМП. С помощью анализа метилома РМП показано, что в качестве таких локусов могут выступать CPG-островки в генах APC, RASSF1, SFRP2, OSR1, OTX1, ONECUT2. Комбинированное определение статуса метилирования этих генов и мутаций FGFR3 в осадке мочи позволяет достигать клинической чувствительности более 70%, тогда как только для гена FGFR3 или при цистоскопии она составляет 50–55% [30, 31].
Таким образом, на основе определения точковых мутаций FGFR3, PIK3CA, TERT может быть разработана тест-система для неинвазивной ДНК-диагностики РМП и его рецидивов по осадку мочи.
Помимо генетических маркеров непрерывно продолжается поиск белков-биомаркеров как для диагностики первых проявлений РМП, так и для контроля за состоянием пациента после лечения.
Активно идет изучение различных биомаркеров, специфических для определенных новообразований и универсальных для онкологических заболеваний. Например, качественный и количественный анализ экспрессии генов p53, RB, Ki67; теломеразы (hTERT); специфических моноклональных антител; эпидермального фактора роста; антигенов РЭА и СА19.9, ингибитора апоптоза Bcl-2; фибронектина и пр. [32]. По данным литературы [12], для определения прогноза лечения пациентов и их выживаемости на различных сроках наблюдения наиболее значимы следующие критерии: стадия опухолевого процесса, определенная по результатам цитологического и гистологического исследования; степень дифференцировки клеток новообразования; поражение регионарных лимфатических узлов; уровень экспрессии нормальной и мутантных форм р53; активность теломеразы.
В последние несколько десятилетий стало развиваться биохимическое направление в диагностике, поиск патогномоничных изменений уровня различных веществ и молекулярных маркеров, которые могли бы улучшить качество диагностики, что может значительно влиять на выбор метода хирургического лечения.
При проведении сравнительного анализа эффективности применения различных молекулярных биомаркеров новообразований МП с ретроградной оценкой морфологической и цитологической характеристик опухолей [33] установлен существенный недостаток молекулярного подхода – его довольно низкая специфичность, не превышающая 73%, что потребовало дополнительного использования других методов исследования для уточнения диагноза, таких как цистоскопия. Все это ограничило широкое распространение методов определения биомаркеров опухолей МП в онкоурологии, однако исследования в данной области активно продолжаются. Так, в США проведено ретроспективное многоцентровое исследование, в общей сложности включившее 125 пациентов с ранее установленным диагнозом РМП, из них у 53 отметили рецидив опухоли, у 72 – дигидрокверцетин-реконвалесценцию [34]. У всех наблюдаемых собрали образцы клеточного материала мочи и далее анализировали с помощью выбранных маркеров методом ELISA, прогноз развития рецидива РМП определяли, исходя из характеристик 10 из них: IL8, MMP9, MMP10, SERPINA1, VEGFA, ANG, CA9, APOE, SERPINE1 и SDC1. Диагностические характеристики панели биомаркеров оценивали с использованием описательных статистических значений (например, чувствительность и специфичность) и графика их зависимости от частоты получения ложноположительных результатов. По итогам исследования установлено, что комбинация всех 10 биомаркеров по значимости превосходила любой отдельный для диагностической панели 0,904 [95% доверительный интервал 0,853–0,956]. Мультиплексный анализ обеспечил общую чувствительность 79% и специфичность 88% для рецидива РМП и продемонстрировал лучшие результаты по сравнению с цитогенетическим методом Uro Vysion (чувствительность – 42%, специфичность – 94%), а также ЦИМ (чувствительность – 33%, специфичность – 90%).
Исследование биомаркеров при РМП с применением выявляемых в моче цитокератинов, представляющих собой растворимые фрагменты, обладает высокой информативностью. Кроме того, включение в диагностические методики выявления указанных веществ позволило разработать новые тест-системы панельного типа с определением CYFRA21.1, тканевого полипептидного антигена, цитокератинов 8, 18 и 19, обладающие более высокой чувствительностью (67–81%) и специфичностью (78–90%) при подозрении на РМП [35].
Проведено множество исследований, в которых определены сигнатуры транскриптов генов, которые подходят для обнаружения РМП [36] или связаны с рецидивом опухоли [37] и результатами нехирургического лечения [38]. Следовательно, транскрипционные биомаркеры в форме мРНК и микро-РНК обладают высокой ценностью для диагностики РМП. Преимущество данного количественного метода в высокой технологической универсальности его компонентов, что делает эти транскрипты идеальным кандидатом для больших, в том числе многоцелевых (диагностических, прогностических и прогнозирующих), маркерных анализов. Тем не менее тщательная независимая оценка их отдельных представителей необходима для формирования оптимальной комбинации целой диагностической панели. Ранее было показано, что уровни транскрипции в моче генов CK20 и IGF2 повышены у пациентов с установленным диагнозом РМП. Известно, что CK20 экспрессируется при РМП, особенно в люминальном подтипе, но лишь в незначительной степени в зонтичных клетках нормального уротелия, поэтому и предложен для диагностики злокачественных образований МП. Данный маркер характеризуется неизменно высокой специфичностью (93–98%) и чувствительностью (83–89%), как сообщалось ранее [39, 40]. Однако как у CK 20, так и у IGF2 отметили меньшую чувствительность при диагностике РМП по сравнению с цитологическим исследованием осадка мочи, что сделало их непригодными в качестве альтернативного метода.
Наиболее перспективным в диагностике и определении прогноза при подозрении на злокачественные новообразованиях среди всех биомаркеров считают анализ экспрессии гена теломеразы (hTERT) и уровня ее активности. Теломераза представляет собой важный для функционирования человеческого организма фермент из группы обратных транскриптаз за счет участия в стабилизации длины теломер клетки при ее многократном делении.
Фермент теломераза относится к классу трансфераз и является по химическому строению РНК-содержащим белком, близким к обратным транскриптазам ретровирусов [41]. Изучение активности теломеразы (АТ) при различных новообразованиях позволило выявить достаточно выраженную связь ее уровня со злокачественностью опухолевого процесса. Исследование различных видов злокачественных новообразований более чем в 85% из них выявило активную теломеразу, тогда как в случае доброкачественных опухолей АТ выявляли с частотой 0–26% [42].
Роль теломер и теломеразы в процессе канцерогенеза, а также возможность моделирующего воздействия на них повышенного уровня активных форм кислорода (АФК) в предопухолевых и опухолевых клетках – весьма актуальная тема для биохимии, однако каких-либо значимых для клинической практики результатов в настоящий момент практически нет. Согласно данным более ранних исследований, клетки неоплазмы отличаются относительно высокой активностью теломеразы. Например, в одной из работ АТ выявлена в 95,2% образцов раковых тканей желудка и в 54,1% тканей, прилежащих к опухоли [43]. При этом во всех изученных образцах нормальных тканей она не обнаружена. В другом исследовании АТ определена в 95% случаев рака молочной железы и 83% случаев рака органов пищеварительного тракта [44], причем длина теломер по всей выборке образцов варьировалась в широких пределах. На основании этих данных был сделан вывод о возможности выявления злокачественных и предраковых клеток при заболеваниях различных органов и тканей по АТ.
Показательна и такая деталь: в опухолевых клетках человека отмечается активность гена hEST2 – гомолога генов, кодирующих каталитическую субъединицу теломеразы у низших эукариот. Этот ген экспрессируется в первичных опухолях, линиях раковых клеток, в обладающих теломеразной активностью тканях и при иммортализации культивируемых клеток. Напротив, ген hEST2 не экспрессируется в дифференцированных тканях, клеточных линиях с неактивной теломеразой и при дифференцировке клеток in vitro. На основании этих данных предположили, что hEST2 есть ген каталитической субъединицы теломеразы человека. По материалам другого исследования [45], экспрессия мутантной каталитической субъединицы теломеразы человека приводит к полному ингибированию активности этого фермента, уменьшению длины теломеры, ограничению роста и времени жизни раковых клеток. Это делает теломеразу важной мишенью для антинеопластической терапии и обусловливает необходимость проведения исследований, направленных на определение наличия и концентрации подобных сигнальных молекул в случае подозрения на опухолевый процесс.
Подобно стволовым, клетки рака предстательной железы (РПЖ) также демонстрируют повышенную АТ [46–48]. Некоторые ученые обнаружили взаимосвязь АТ со степенью клеточной дифференцировки по шкале Глисона и степенью инвазии опухоли [49]. В последние несколько лет активно проводят разработку ингибиторов теломеразы для проведения терапии РПЖ [50].
Активность теломеразы при почечно-клеточном раке определяют реже, чем при других злокачественных заболеваниях. Даже в случае обнаружения повышенной АТ ее уровень не коррелирует с клинико-патологической картиной заболевания (с гистопатологической шкалой, плоидностью ДНК, стадией опухолевого процесса и клиническими проявлениями) [51]. Таким образом, АТ может быть потенциальным маркером злокачественного процесса, но не прогностически важным маркером в случае почечно-клеточного рака [52].
Группа японских исследователей смоделировала метод определения теломеразы в моче с помощью простого мочевого теста на АТ на основании модификации последовательности ТTAGGG в ПЦР и ферментсвязанной иммуносорбирующей системы для диагностики РМП. Чувствительность и специфичность метода в данном исследовании составили 81 и 92% соответственно, что является наиболее высокими показателями по сравнению с результатами других групп ученых, проводивших аналогичные исследования [53].
В ряде исследований зарубежных ученых по выявлению РМП чувствительность теста по анализу теломеразы колебалась от 46 до 85% при диапазоне специфичности от 24 до 99% [54–59]. Данные результаты не могут не вызывать недоумения по столь значительному разбросу в значениях чувствительности и специфичности анализа теломеразной активности.
Сочетание ЦИМ с определением фибронектина в моче, или TRAP, или CK20 продемонстрировало более высокую чувствительность метода – 98,4% при постановке диагноза у 132 пациентов со злокачественными опухолями мочевого пузыря по сравнению с одним лишь цитологическим исследованием [60].
В серии обследований 123 больных РМП комбинация анализа hTERT и цитологического исследования показала более высокие результаты по сравнению с комбинацией таких методов, как цитологическое исследование и определение других маркеров в моче с помощью ПЦР, показавших чувствительность 71% и специфичность 86% [61].
A. Lamarca et al. [62] считают, что наиболее важную роль теломераза играет как мочевой биомаркер именно при РМП. Авторы продемонстрировали эффективность применения техники определения теломеразы у онкоурологических пациентов в моче. По результатам исследования чувствительность метода колебалась в пределах 70–100%, специфичность – 60–70%. Проблема диагностирования РМП стоит гораздо острее у тех пациентов, у которых уже подозревали наличие заболевания. Все это требует дальнейших исследований.
В большом обзоре [63] чувствительность и специфичность для каждого маркера мочевого пузыря оценивались с использованием двумерного мета-анализа случайного эффекта. Всего в анализ было включено 42 исследования. Цитологический анализ показал себя как тест с лучшей специфичностью (94%), значительно превосходящей данный показатель других маркеров, речь о которых шла выше. При этом чувствительность теста во внимание не принималась, хотя, по данным литературы, этот показатель лежит в диапазоне от 40 до 62% [56, 64–66], т.е. является низким. Для метода анализа теломеразы чувствительность составила 75%, специфичность – 86%. Это исследование показало, что цитологический анализ и анализ теломеразы лучшие в клинической практике и, возможно, пригодны для клинического применения в комбинации. Однако авторы исследования не рискуют рекомендовать ни один из маркеров для повседневного использования в качестве «золотого» стандарта. Для поддержки такого заключения, по их мнению, необходимы дополнительные еще более масштабные массивы данных.
Применение методик определения АТ и hTERT в образцах мочи онкоурологических пациентов продемонстрировало примерно одинаковые результаты [67]. Проблема развития данных технологий как диагностических методов и снижения количества ложноположительных результатов из-за симптомов поражения урогенитального тракта, воспаления или инфекции остается пока не решенной, так как нет значительной корреляции между экспрессией белка hTERT и активностью теломеразы, анализ АТ более предпочтителен при диагностике РМП. А этот старый вариант удалить. Более того, потеря непосредственной связи между белковой экспрессией hTERT и АТ в сравнительных исследованиях показало более высокие результаты при определении в моче активности теломеразы с помощью TRAP. Таким образом, TRAP продемонстрировал хороший потенциал и эффективность при использовании не столько для обнаружения злокачественных клеток в области урогенитального тракта, сколько для диагностирования РМП у пациентов с его симптоматикой и в подгруппах высокого риска по данному заболеванию [68].
В работе А. И. Глухова и соавт. [69] приведены исследования по разработке методики неинвазивной диагностики РМП с использованием анализа АТ в образцах ткани опухоли мочевого пузыря и клеточных осадков мочи пациентов неизотопным методом TRAP. Также были измерены уровни относительной экспрессии ее каталитической субъединицы hTERT и РНК-субъединицы (hTR) методом ОТ-ПЦР. Активность теломеразы и экспрессия генов, кодирующих ее субъединицы, выявлялись как в ткани опухоли, так и в клеточном осадке мочи каждого пациента. Данные показали возможность проведения неинвазивной диагностики РМП с использованием комбинации указанных методов с чувствительностью и специфичностью в 96 и 100% для анализа АТ и 80 и 100% для анализа экспрессии гена hTERT.
Неизотопный метод TRAP можно применять при диагностике РМП, однако для его широкого внедрения в онкоурологическую практику требуется проведение более масштабных дополнительных исследований [70, 71].
Определение АТ у пациентов для прогнозирования развития доброкачественных и злокачественных заболеваний урогенитального тракта остается открытым.
Заключение. Данный обзор посвящен современным неинвазивным методам диагностики РМП, актуальность изучения которых не приходится объяснять. На сегодняшний день существуют различные онкомаркеры/диагностические панели маркеров на основании анализа мочи как для первичной диагностики РМП, так и для оценки проведенного лечения (хирургического и нехирургического); как для контроля рецидивирования НМИРМП, так и для оценки прогноза РМП. Однако на сегодняшний день универсального онкомаркера или панели маркеров для неинвазивной диагностики РМП пока не существует, что свидетельствует о необходимости продолжения исследований, посвященных созданию и поиску универсального онкомаркера/диагностической панели маркеров на основании анализа мочи, отвечающих всем требованиям клиницистов, который использовался бы в рутинной медицинской практике.
