Введение. Основной особенностью современного этапа развития хирургического лечения нефролитиаза является переход от традиционных открытых вмешательств, доля которых в мире составляет 0,7–2%, к малоинвазивным высокотехнологичным методикам [1]. По данным разных авторов, у 7–76,7% пациентов после удаления конкрементов возникает рецидив в течение года [2, 3].
В патогенезе рецидивного нефролитиаза после перкутанной нефролитотрипсии (ПНЛ) инфекционный фактор играет существенную роль [4–6]. При том что наряду с уреазопродуцирующей микробной флорой (Proteus spp., Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter spp.), камнеобразование могут потенциировать и микроорганизмы, не продуцирующие уреазу (Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Enterococcus spp., Escherichia spp., Klebsiella spp.) [7, 8]. Отмечается, что у 92% пациентов уролитиаз протекает на фоне пиелонефрита (коралловидный уролитиаз – у 100%) [9, 10].
В связи с этим представляется весьма актуальным поиск альтернативных методов для предотвращения хронического воспалительного процесса, обусловленного антибиотикорезистентной микробной флорой. Одним из перспективных направлений профилактики вторичного инфицирования почки после перкутанной нефролитотрипсии (ПНЛ) и развития рецидивного нефролитиаза является специфическая иммунизация антигенами наиболее значимых микробных агентов в сочетании с пробиотическими препаратами на основе бактерий, обладающими высоким микробным антагонизмом в отношении условно-патогенной микрофлоры и лишенных факторов патогенности для человека.
В своем исследовании мы использовали вакцину стафило-протейно-синегнойную адсорбированную жидкую (СПСА-вакцину). Нами накоплен большой опыт по применению этой вакцины для профилактики гнойно-воспалительных осложнений после операций на органах мочевыделительной системы [11]. Для воздействия на антибиотикорезистентные формы уропатогенов мы использовали пробиотик на основе сенной палочки Вacillus subtilis, обладающий выраженным микробным антагонизмом, в том числе к микроорганизмам в составе микробных биопленок. Эффективность Вacillus subtilis в отношении инфекции верхних и нижних мочевых путей продемонстрирована в ряде исследований, особенно при госпитальной катетер-ассоциированной инфекции [12].
Основная задача, положенная в основу исследования, – найти понимание, насколько эффективность лечения вторичного пиелонефрита и достижение его длительной ремиссии могут предотвращать или отсрочивать вероятный рецидив камнеобразования. Для этого мы включили в исследование пациентов с факторами высокого риска раннего рецидива. Сравнительный характер исследования заключался в оценке отдаленных результатов лечения при использовании как традиционных подходов к лечению, так и при сочетании традиционных подходов с иммунобиологическими препаратами.
Цель исследования: целью нашего исследования стало изучение влияния профилактической иммунизации ассоциированной СПСА-вакциной в сочетании с пробиотиком Вacillus subtilis на развитие рецидивного нефролитиаза у пациентов после ПНЛ.
Материалы и методы. В исследовании участвовали пациенты с мочекаменной болезнью, которым по поводу камней почек более 2 см потребовалось выполнение чрескожной пункционной нефролитотрипсии (ПНЛ). Все пациенты, вошедшие в исследование, имели высокий риск рецидива нефролитиаза за счет инфекционного фактора. Основные критерии включения пациентов в исследование: наличие исходно инфицированных камней почек (апатиты, струвиты), наличие хронического пиелонефрита, обусловленного уреазопродуцирующей микробной флорой, энтерококком, стафилококком, а также случаи раннего (в первые 2 года) рецидива мочекаменной болезни после выполненных оперативных вмешательств. Тест на бактериологическую обсемененность мочи у всех пациентов был положительным.
Обязательным условием включения было достижение после ПНЛ состояния Stonе free.
Критерии исключения: беременность, сопутствующие заболевания в стадии декомпенсации, обострение инфекционно-воспалительных заболеваний, терминальная стадия хронической болезни почек, коагулопатии, аномалии органов мочеполовой системы с нарушением оттока мочи, возраст младше 18 лет.
С целью определения эффективности иммунизации для профилактики рецидивного нефролитиаза нами были сформированы группы сравнения. Для определения оптимальной схемы иммунизации основное внимание в этих группах было обращено на увеличение специфических антител к наиболее проблемным представителям мочевой инфекции (Proteus spp., Ps. aeruginosa, Staphylococcus spp.), а также на повышение неспецифической иммунорезистентности на фоне вакцинации. Выполнено сравнение клинических и лабораторных результатов иммунизации пациентов, готовящихся на плановые малоинвазивные оперативные вмешательства в группах (табл. 1).
Группа «А» включила 20 пациентов, которым проведена профилактическая активная иммунизация стафило-протейно-синегнойной адсорбированной вакциной по стандартной схеме перед выполнением ПНЛ.
Группа «Б» – 26 пациентов, в отношении которых применено сочетание активной иммунизации СПСА-вакциной с пробиотическим препаратом Бактиспорин сухой.
Группа сравнения включила 30 пациентов, сходных по половозрастному составу, нозологии, виду оперативного вмешательства, которым дооперационная подготовка и послеоперационное ведение после ПНЛ проводилось согласно действующим клиническим рекомендациям.
В своем исследовании мы использовали вакцину стафило-протейно-синегнойную адсорбированную жидкую (СПСА-вакцину), (Р. 96.309.123-3, ВФС 42-2685-96, производитель ГУП «Иммунопрепарат»), имеющую в своем составе альфа-анатоксин и цитоплазматический антиген Staphylococcus aureus, «химический» антиген Proteus mirabilis и анатоксин Pseudomonas aeruginosa.
В качестве пробиотика мы применили биологический препарат на основе лиофилизированных живых бактерий Bacillus subtilis штамм ЗН (Бактиспорин сухой), обладающих высокой антибактериальной, ферментативной и иммуномодулирующей активностью, оставаясь безвредными для человека. Бактерии данного вида обладают высокой антагонистической активностью, продуцируя около 200 известных антибиотических веществ пептидной природы и ферментов, подавляющих развитие патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, обладают положительным комплексным воздействием на макроорганизм, включающим стимуляцию неспецифических факторов иммунорезистентности, устранение дисбиотических нарушений организма [11, 15].
Согласно разработанной схеме лечения, проводилась двукратная вакцинация пациентов СПСА вакциной в дозе 0,5 мл на фоне назначения препарата Бактиспорин сухой по 2-5х109 микробных клеток 3 раза в день внутрь в течение 14–20 дней.
Длительность наблюдения пациентов в группах после оперативного лечения составила 36 мес. Цель наблюдения – выявление обострения хронического пиелонефрита и контроль рецидивного нефролитиаза. Наблюдение проводилось в очной форме амбулаторно и дистанционно с использованием медицинской базы ПРОМЕД.
Микробиологические исследования средней порции мочи выполнялись методом культуральных посевов на плотные питательные среды в соответствии с требованиями приказа МЗ СССР «Об унификации микробиологических методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений» № 535 1985 г. на базе Бактериологического центра РКБ им. Г. Г. Куватова.
Забор образца лоханочной мочи производился интраоперационно сразу после пункции чашечно-лоханочной системы. Полученные во время операции фрагменты камня в стерильных условиях мелко фрагментировались в стерильной ступке. Видовой состав микроорганизмов из лоханочной мочи и камней идентифицировался на анализаторе BioMerieux MS VITEK по технологии MALDI-TOF (матричная лазерная десорбционная времяпролетная масс-спектрометрия). Образцы мочи и раздробленные в стерильных условиях камни помещались в бульон для анаэробного (BacT/ALERT*FN Plus) и аэробного (BacT/ALERT*FA Plus) культивирования в аппарате BacT/ALERT 3D120. Постановка чувствительности к антибиотикам проводилась на анализаторе BioMerieux VITEK 2COMPACT.
Определение химического состава камня проводилось методом рентгеноструктурного анализа и при помощи сканирующей электронной микроскопии.
Эффективность иммунного ответа на СПСА-вакцину оценивали путем определения специфических антител в сыворотке крови в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) с использованием специфических эритроцитарных диагносткумов: стафилококкового, протейного и синегнойного производства НИИ вакцин и сывороток им И. И. Мечникова, Уфа (ВФС-42-2842-97, утверждено в 11.03.1997). С этой целью проводилось исследование парных сывороток, полученных от пациентов до вакцинации, через 7, 14 и 28 сут. после введения вакцины. Для определения длительности сохранения защитных тиров специфических антител в крови после предложенной схемы иммунизации исследование проводилось и в отдаленные сроки. Максимальный срок наблюдения за уровнем титров составил 12 мес.
Статистическая обработка полученных данных осуществлялась в операционной среде Windows с использованием пакета Microsoft Offise Excel и программы «Statistica». Если показатель имел нормальное распределение, применялись методы параметрической статистики с использованием t-критерия Стьюдента (средняя арифметическая и ее стандартная ошибка). Для показателей, не имевших нормального распределения, вычислялась медиана. Достоверность различий иммунологических показателей в процессе лечения определялась с помощью критерия Вилкоксона. Корреляционный анализ включал определение коэффициента ранговой корреляции Спирмана. Для каждого показателя определялся уровень его значимости.
Результаты. У больных хроническим пиелонефритом на фоне нефролитиаза в первичных посевах пузырной мочи, выполненных на догоспитальном этапе методом культуральных посевов, отмечалось преобладание монокультур Enterobacter spp., E. coli, Proteus spp. При исследованиях пузырной мочи, выполненных на 5–7-е сутки послеоперационного периода, в этиологии инфекции мочевых путей снижение частоты встречаемости E.coli, Enterobacter spp. сопровождался увеличением доли штаммов Proteus spp., P. aeruginosa, Klebsiella spp., отмечался рост микробных ассоциаций кишечной палочки и протея со штаммами Klebsiella spp., Enterococcus spp., Serratia spp.
Изучение микробной флоры лоханочной мочи методом масс-спектрометрии показало, что основными представителями микробной флоры мочи из лоханки почки на момент операции были E.coli, Klebsiella pneumonia, Enterobacter cloacae (рис. 1). При этом основными микробными агентами в камнях почек были Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus epidermidis. В 25,7% случаев встречались микробные ассоциации (рис. 2).
Такая разница в микробном спектре лоханочной мочи и удаленных конкрементов достаточно убедительно показывает, что микроорганизмы на поверхности и в структуре камней находятся в составе микробных биопленок и не выявляются при рутинных бактериологических методах исследования мочи. Преобладание в микробной флоре, выделенной из почечных камней, синегнойной палочки и энтерококка можно объяснить перенесенными ранее операциями и эндоскопическими вмешательствами, увеличивающими риск контаминации почек госпитальной флорой.
Вакцина продемонстрировала хорошую иммуногенность, ее антигенные компоненты обеспечивали протективные свойства в отношении аутологичных и близкородственных условно-патогенных микробов (стафилококковый компонент – в отношении и Staphylococcus aureus, и Staphylococcus epidermidis; протейный – в отношении Proteus mirabilis и Proteus vulgaris). Помимо способности вызывать специфический ответ на антигены вакцина обладала способностью индуцировать фагоцитарную активность нейтрофилов. Поскольку всем бактериям, антигены которых входят в состав вакцины, чаще всего свойствен внеклеточный тип паразитизма, а защита от них обеспечивается индукцией антителогенеза, при исследовании иммуногенности вакцины мы ориентировались в первую очередь на показатели уровня антител в серологических реакциях.
К больным, готовящимся к плановым оперативным вмешательствам, применялась двукратная схема иммунизации, предполагающая введение 0,5 мл вакцины подкожно с последующей ревакцинацией через 14 дней. На момент операции кратность превышения достигнутых титров над исходными значениями составила в среднем для антистафилококковых антител 5, для антипротейных 2,3, для антисинегнойных 4. Уровень антистафилолизина возрос в 3,2 раза. Преимущество двукратной схемы иммунизации перед однократной проявлялось в дальнейшем нарастании титра специфических антител после ревакцинации (рис. 3). Более выраженный иммунный ответ в сочетании с низкой реактогенностыо вакцины послужили основанием использования в дальнейшем этой схемы иммунизации.
Достигнутые титры специфических антител сохранялись после иммунизации в течение 3 мес., затем отмечено медленное снижение значений, но протективный уровень антител сохранялся до 12 мес. при двукратной схеме вакцинации (максимальный срок наблюдения за титрами антител в нашем исследовании).
Сочетание СПСА-вакцины с пробиотиком Бактиспорин ускоряло приближение уровня лейкоцитов к норме практически в 2 раза, чем при применении только СПСА-вакцины (13,5±3,5х109л и 7,0±1,3х109л) и сохраняла тенденцию к снижению при последующих исследованиях (табл. 2 и 3).
При введении СПСА-вакцины не наблюдалось достоверных изменений уровня иммуноглобулинов классов А и М. При сочетанном введении иммунопрепаратов (СПСА-вакцина и Бактиспорин) отмечено нарастание иммуноглобулинов всех классов, наиболее выраженное на 14-е сутки исследования (IgA на 65%, IgM на 46% и IgG на 27%).
На 7-е сутки после введения вакцины титр антител к синегнойной палочке возрос в 3,2 раза, тогда как к другим микроорганизмам он достоверно не увеличился. Нарастание титров антител в этой группе происходит к 14-м суткам: к синегнойной палочке – в 9,2 раза, к стафилококку – в 2,7. После введения СПСА-вакцины на фоне терапии препаратом B. subtilis имеет место увеличение на 7-е сутки после иммунизации титров антител к синегнойной палочке в 6,4 раза, к стафилококку в 2,8, к протею в 4,2 раза. На 14-е сутки титры антител к этим микроорганизмам оставались высокими, хотя имелась тенденция к их снижению.
Проведенный сравнительный анализ двух схем активной иммунизации больных с высоким риском развития инфекции мочевых путей в послеоперационном периоде выявил преимущество комбинации двухэтапной вакцинации СПСА-вакциной с пробиотикотерапией В. subtilis по сравнению с проводимой двухэтапной иммунизацией. Это преимущество выявлено во всех звеньях иммунитета, поскольку наиболее выраженная активация как гуморального, так и клеточного звеньев иммунитета происходит уже к седьмым суткам после вакцинации.
Иммунизация СПСА-вакциной на фоне применения пробиотикотерапии способствовала неосложненному послеоперационному течению у 84% пациентов. Инфекционно-воспалительные осложнения в раннем послеоперационном периоде отмечались в 16,2% случаев. Рецидив камнеобразования в этой группе больных в течение 36 мес. составил 8,2%. При введении в схему подготовки к ПНЛ только иммунизации СПСА-вакциной послеоперационный период протекал без осложнений у 65% пациентов, развитие инфекции верхних мочевыводящих путей отмечено у 35% пациентов, при этом воспалительный процесс сопровождался легкими клиническими проявлениями и быстро купировался. Рецидив камнеобразования в сроки наблюдения был отмечен у 18% больных. В группе контроля доля неосложненных случаев на фоне наружного дренирования составила 40%, развитие пиелонефрита отмечено в 60% случаев, выявление рецидивных камней в течение 36 мес. отмечено в 46,7% случаев.
Обсуждение. Современные малоинвазивные технологии лечения мочекаменной болезни, основанные на минимизации повреждающего воздействие на ткани почки и мочевых путей, не только не привели к уменьшению случаев рецидива мочекаменной болезни, но и характеризуются ростом случаев раннего рецидивного нефролитиаза в течение первых 5 лет после операции [1, 3]. На наш взгляд, наряду с резидульными фрагментами камней после внутрипочечной дезинтеграции в увеличении с доли рецидивов играет инфекционный фактор. Дробление в полостях почки камня, покрытого биопленкой, приводит к распространению бактериальной микробной флоры по чашечно-лоханоной системе, инфицированию интерстиция почки в результате повышения внутрилоханочного давления и способствует развитию хронического воспалительного процесса, обусловленного антибиотикрезистентной микробной флорой. Согласно нашим исследованиям, микробная флора мочи и камня в большинстве случаев не совпадает и назначение антибактериальной терапии, основанной на выявлении планктонных форм микробов в моче, зачастую не позволяет защищать почку от инфицирования и способствует хронизации воспалительного процесса. Это обстоятельство, на наш взгляд, и лежит в основе быстрого рецидива камней в оперированной почке. Особенно когда инфекционные агенты представлены уреазопродуцирующей микробной флорой или обладают высокой активностью в отношении биопленкообразования. При этом стандартные подходы лечения оказываются неэффективными.
Предложенный нами метод позволяет повышать специфическую резистентность в отношении наиболее проблемных микробных возбудителей, обладающих целым комплексом факторов патогенности и уреазной активности. Специфическая иммунизация СПСА-вакциной направлена как на создание защитного уровня антител в отношении клинически значимых бактерий, так и на активацию неспецифической фагоцитарной активности в отношении бактериальных агентов. Примененная схема вакцинации рассчитана на пациентов с высоким риском рецидива камнеобразования: имеющих камни инфекционного генеза, рецидивные камни почек, рецидивирующий пиелонефрит на фоне мочекаменной болезни. Вакцинация проводилась в период предоперационной подготовки в два этапа. Использование сочетания: пробиотик Бактиспорина и СПСА-вакцина, позволило добиться более быстрого нарастания титров защитных антител по сравнению со стандартной методикой. Доказано, что Вacillus subtilis, активируя дендритные клетки лимфоидной ткани желудочно-кишечного тракта, оказывает иммуномодулирущее действие на систему клеточного иммунитета, индуцирует секрецию IL-12, -2, -6, -10, гамма-интерферона и фактора некроза опухоли альфа [13–15]. Наряду с активацией клеточного звена адаптивного иммунитета Вacillus subtilis при пероральном применении вызывают Th2-поляризационные иммунные реакции, способствующие продукции В-клеток и антителогенезу [15–17]. Данная особенность Вacillus subtilis – значительно повышать потенциал для индукции антителоопосредованных иммунных механизмов защиты против инфекционных заболеваний – реализована в нашем исследовании. Мы применили препарат Вacillus subtilis в качестве адъюванта проводимой вакцинации СПСА-вакциной. Это позволило создать у пациентов протективный титр антител уже к моменту оперативного вмешательства. Высокий защитный титр антител сохранялся в течение года после вакцинации (период наблюдения). Кроме этого применение препарата Bacillus subtilis – пробиотика, обладающего высокой степенью антагонистической активности в отношении возбудителей мочевой инфекции, в том числе в составе микробных биоплёнок, позволило значительно сократить время купирования активного пиелонефрита в раннем послеоперационном периоде.
Заключение. Предложенный нами метод метафилактики мочекаменной болезни у пациентов с высоким риском рецидива камнеобразования показал достаточно хороший эффект в период трехлетнего наблюдения. Наши результаты еще раз подчеркивают, что роль инфекционного фактора в развитии рецидивного нефролитиаза после ПНЛ зачастую недооценена. Назначение специфической вакцинации (СПСА-вакцина) и препарата Bacillus subtilis пациентам с высоким инфекционным риском рецидива камнеобразования позволил добиться значительного снижения случаев рецидивного нефролитиаза (более чем в 5 раз) по сравнению с контрольной группой на протяжении 36 мес. наблюдения после ПНЛ.
