Покрытие маслом культуральной среды (именуемой в дальнейшем «среда») в чашках, где культивируются эмбрионы, является методом, используемым в эмбриологии еще с 1960-х гг. [1, 2]. Масло предотвращает повреждение ооцитов и эмбрионов, которое может возникнуть во время культивирования в СО2-инкубаторе или при рутинных манипуляциях вне инкубатора [3, 4]. Кроме того, среда, покрытая маслом, меньше подвержена загрязнению частицами из внешней среды и лучше защищена от контаминации микроорганизмами [2, 5]. Стандартная методика поддержания влажности, используемая в СО2-инкубаторах, может приводить к испарению сред и изменению их осмолярности [5]. Поэтому важным позитивным эффектом от использования масла при культивировании эмбрионов in vitro является защита среды от изменения осмолярности [3].
Культивирование эмбрионов в отдельных каплях является одним из стандартных методов в современных лабораториях экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) [1, 6]. Несмотря на то что эмбрионы млекопитающих толерантны в большом диапазоне осмолярности, для эмбрионов человека необходима постоянная осмолярность среды при культивировании [2, 3]. Ее значение является критическим для процесса формирования бластоцист [2]. Отклонение параметра pH в средах может влиять на метаболизм эмбрионов, а осмотический стресс оказывать негативное влияние на их жизнеспособность [2, 3].
С другой стороны, использование масла при культивировании эмбрионов может оказывать не только положительное влияние на их развитие [4, 7]. Во время производства, транспортировки и хранения масла возможна его контаминация веществами, которые могут оказать токсичное воздействие на ооциты и эмбрионы [7–9]. Такие соединения могут аккумулироваться в масле [8, 9]. В ряде исследований на мышиных, коровьих и человеческих эмбрионах было показано, что токсичные вещества могут экстрагироваться из масла в культуральную среду [3, 8–10]. В связи с этим может быть рекомендована «отмывка» масла перед его использованием для культивирования, то есть эквилибрация масла в течение 24 ч и более с водой и/или средой, в которой впоследствии будут культивироваться эмбрионы [8].
Минеральное масло разных производителей может отличаться по вязкости, плотности и качественному составу [4, 9]. Более того, различные лоты масла одного и того же производителя могут отличаться по своим физико-химическим свойствам и оказывать, таким образом, различное влияние на жизнеспособность эмбрионов при культивировании in vitro. Поэтому перед использованием масла как элемента в системе культивирования эмбрионов, его желательно тестировать с использованием биологической пробы.
Целью настоящего исследования было сравнение двух вариантов коммерчески доступного масла, которое предназначено для культивирования эмбрионов in vitro.
Материалы и методы
Исследование по культивированию эмбрионов-сибсов с использованием минерального и парафинового масла проводилось в клинике репродукции человека «АльтраВита». В исследовании приняли участие 84 пары, проходящие лечение бесплодия методами ЭКО, у которых в результате индукции суперовуляции было получено более 10 зрелых ооцитов MII. Пациенты, дополнительно использующие предимплантационное генетическое тестирование, исключались из исследования.
Данное исследование было одобрено этическим комитетом Клиники репродукции человека «АльтраВита». Все пациенты, включенные в исследование, были информированы о нем до пункции яичников и подписали информированное согласие.
Индукцию суперовуляции проводили в коротком протоколе с использованием антагонистов гонадотропин-рилизинг-гормона. Со 2–3-го дня менструального цикла назначались рекомбинантные и/или мочевые гонадотропины в суточной дозе 150–300 МЕ. Овуляцию инициировали введением хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) в дозе 10 000 МЕ за 34–36 ч до пункции яичников.
Ооцит-кумулюсные комплексы, полученные во время пункции, отмывали дважды в среде HTF media (IVF basics, Gyniotec, Netherlands) и ожидали дальнейшей денудации в среде HTF media (IVF basics, Gyniotec, Netherlands) с добавлением 10% белка Life Global Protein supplement (LGPS, Life Global, USA) под слоем минерального масла. Денудацию ооцит-кумулюсных комплексов проводили через 1 ч после пункции яичников. Ооцит-кумулюсные комплексы кратковременно помещали в среду, содержащую гиалуронидазу (Hyadase, Vitromed, Germany), а затем механически дочищали мягким пипетированием в HTF HEPES media (IVF basics, Gyniotec, Netherlands) с добавлением 10% белка Life Global Protein supplement (LGPS, Life Global, USA). Подготовку спермы к оплодотворению осуществляли путем центрифугирования в градиенте плотности. Интрацитоплазматическую инъекцию сперматозоидов (ИКСИ) проводили через 2 ч после денудации в среде HTF HEPES media (IVF basics, Gyniotec, Netherlands) с добавлением 10% белка Life Global Protein supplement (LGPS, Life Global, USA). Распределение по сплит-группам проводили после оплодотворения. Ооциты случайным образом распределяли на две группы 1:1 и помещали в две разные лунки четырехлуночного планшета со средой Vitromed One Step medium (Vitromed, Germany) с добавлением 10% белка Life Global Protein supplement (LGPS, Life Global, USA). При этом первая лунка была покрыта минеральным маслом (Mineral oil, Sigma-Aldrich Inc., REF: M5310), а вторая – парафиновым маслом (Oil for IVF culture (light paraffin oil), Vitromed GmbH, REF: V-OIL-P100).
Результат оплодотворения ооцитов оценивали через 16–18 ч после ИКСИ; зиготы с 2 пронуклеусами (2PN) переносили для культивирования в микрокапли (20 мкл) среды Vitromed One Step medium (Vitromed, Germany) с добавлением 10% белка Life Global Protein supplement (LGPS, Life Global, USA) под слоем соответствующего масла (минерального или парафинового), покрывавшего чашку в объеме 6,0 мл. Чашки для культивирования подготавливали заранее и эквилибрировали в течение 12–14 ч в СО2-инкубаторе. Далее эмбрионы культивировались одновременно в одном и том же СО2-инкубаторе (Thermo Scientific, USA) в атмосфере с 6% СО2 при 37°C и максимальной влажности в течение всего периода инкубации.
Оба типа масел перед использованием инкубировали в течение 24 ч с водой (вода для растворов стерильная для культур клеток, «БиолоТ», Россия) при 4°C, а затем 24 ч со средой Vitromed One Step medium (Vitromed, Germany) в СО2-инкубаторе с 6% CO2 при 37°C.
Стадию дробления эмбрионов анализировали на 3-и сутки развития по стандартным критериям оценки, основанным на морфологических параметрах (количество и размер бластомеров, степени фрагментации). Бластоцисты анализировали на 5–6-е сутки развития по размеру (от 1 до 6), качеству внутренней клеточной массы (А, В, С) и трофэктодермы (А, В, С) по Гарднеру. Бластоцисты качества ВВ и выше, размером 3 и более были либо перенесены в цикле стимуляции, либо витрифицированы. Перенос эмбриона в цикле стимуляции осуществляли на 5-е сутки развития. Бластоцисты были витрифицированы по протоколу Cryotech (Vitrification Kit 101, Cryotech, Tokyo, Japan). Бластоцисты для переноса в криоцикле были разморожены по протоколу Cryotech (Warming Kit 102, Cryotech, Tokyo, Japan) и находились до переноса в полость матки в СО2-инкубаторе в течение 2 ч после оттаивания, без покрытия чашек маслом.
Для определения эффективности использования двух типов масел оценивали такие параметры, как частота получения правильно оплодотворенных зигот 2PN (Fertilization rate, FR), частота дробления эмбрионов (Cleavage rate, ClR), частота образования бластоцист (Blastocyst rate, BlR) и бластоцист хорошего качества (Utilization rate, UR), частота имплантации эмбрионов (Implantation rate, IR) и получения клинических беременностей (Clinical pregnancy rate, CR) после переноса в цикле стимуляции и криоцикле. Наступление клинической беременности фиксировали по результатам ультразвукового исследования, проведенного через 14 дней после получения положительного результата на β-ХГЧ.
Статистический анализ
Для таких показателей, как количество ооцит-кумулюсных комплексов, полученных на пункции, количество зрелых ооцитов, количество бластоцист и бластоцист хорошего качества, количество эмбрионов на перенос при описании и сравнении групп были использованы средние арифметические показатели (M) с указанием стандартного отклонения (SD). Для сравнения средних значений двух независимых выборок применяли непараметрический критерий Манна–Уитни. Расчет частоты правильного оплодотворения, образования бластоцист, наступления беременности при переносе эмбриона в цикле стимуляции, наступления беременности в криопереносе проводили целиком по всей группе, для сравнения этих категориальных данных использовали критерий хи-квадрат (χ2). Оценка статистической значимости различий выполнялась с уровнем значимости p<0,05.
Результаты
В исследование было включено 1490 ооцитов MII, полученных от 84 пациенток в 84 циклах индукции суперовуляции. Возраст пациенток варьировал от 26 до 45 лет на момент пункции яичников, средний возраст женщин составил 31,3 года (табл. 1).
Частота нормального оплодотворения (80,4% (586/729) и 80,4% (612/761) соответственно) и доля дробящихся эмбрионов (98,6% (578/586) и 99,2% (607/612) соответственно) не показали статистически значимых различий в группах с использованием минерального и парафинового масла.
Частота образования бластоцист (64,5% (378/586) и 75,3% (461/612) соответственно) и частота образования бластоцист хорошего качества (43,2% (253/586) и 57,0% (349/612) соответственно) имели статистически значимые различия и были ниже в группе, где использовали минеральное масло, по сравнению с группой парафинового масла. Среднее количество бластоцист и бластоцист хорошего качества, полученных в результате проведения эмбриологического этапа в группах с использованием минерального и парафинового масла, составило 4,5 и 3,0 эмбриона против 5,5 и 4,2 эмбриона соответственно. Не было обнаружено статистически значимых различий между группами с использованием минерального и парафинового масел по частоте имплантации эмбрионов и наступлению клинической беременности (при переносе эмбрионов в цикле стимуляции и в криоцикле) (табл. 2).
Обсуждение
Масло как элемент системы культивирования эмбрионов используется для покрытия микрокапель среды, в которых находятся эмбрионы. Таким образом, масло поддерживает стабильность среды на протяжении всего периода культивирования в CO2-инкубаторе, а также во время краткосрочных рутинных манипуляций с ооцитами и эмбрионами вне инкубатора [2]. Несмотря на то что целью покрытия среды маслом является защита эмбрионов от окружающей среды, резких колебаний температуры и осмолярности, масло также выступает в качестве потенциального источника эмбриотоксичных соединений, которые могут негативно повлиять на жизнеспособность эмбриона [11]. Масло от разных производителей отличается по вязкости, качеству, степени очистки и может по-разному влиять на развитие эмбриона при культивировании in vitro [11, 12]. На рынке доступно большое количество коммерческих масел для культивирования эмбрионов человека, но лишь в немногих исследованиях напрямую сравнивалась их эффективность и безопасность с точки зрения результативности циклов ЭКО.
Первые исследования о влиянии разных типов масел при использовании их для покрытия микрокапель на результаты ЭКО у человека были проведены в конце 2000-х гг. [11]. Исследователи не наблюдали статистически значимой разницы в показателях оплодотворения и наступления беременности [11]. Однако среднее количество эмбрионов высокого качества на 3-й день было статистически выше в группе с использованием парафинового масла [10]. В настоящей работе использование для культивирования разных типов масел не повлияло на частоту дробления эмбрионов на 3-и сутки развития. В исследовании Sifer C. et al. сравнивалось качество эмбрионов на стадии дробления; однако мы отслеживали только наличие дробления или его отсутствие, независимо от качества [10]. Вероятно, этот фактор, а также фактор, обусловленный «разными производителями» масла, в их и нашем исследовании могут объяснять разницу в полученных результатах. К тому же в исследовании Sifer C. et al. перенос эмбрионов осуществляли на 2–3-и сутки, тогда как в настоящем исследовании перенос осуществлялся на 5-е сутки на стадии бластоцисты хорошего качества. Таким образом, некорректно сравнивать результаты по показателю получения беременностей в нашем случае с результатами вышеописанного исследования.
В другом исследовании сравнилось влияние питательных сред, покрытых парафиновым и минеральным маслами, на показатели развития in vitro и использования эмбрионов человека 3-го дня. Исследование было проведено в сиблинг-сплитах на 1237 яйцеклетках [12]. В отличие от предыдущего, это исследование не выявило никакой разницы в развитии эмбрионов до 3-го дня между двумя группами, что также согласуется с нашими результатами.
Мы отметили, что два протестированных масла оказали сходное влияние на процент правильного оплодотворения ооцитов. Сходная картина наблюдалось и в других исследованиях [11, 12].
В текущем исследовании мы сравнили результаты культивирования эмбрионов до стадии бластоцисты с использованием двух типов масел. Таким образом, мы могли оценить жизнеспособность эмбрионов и их качество на более поздних стадиях развития. Мы наблюдали увеличение общего числа бластоцист и количества бластоцист хорошего качества в группе эмбрионов, где использовалось парафиновое масло, по сравнению с группой, где культивирование осуществляли под слоем минерального масла. Вероятно, эту разницу можно объяснить тем, что некоторые масла могут оказывать, в большей или меньшей степени, токсическое воздействие на развитие эмбрионов [2, 8, 13]. Такое воздействие может быть следствием особенностей производства у различных производителей, таких как тип промышленной очистки, тип тары для хранения, а также особенностей перевозки, хранения и использования масла в лаборатории, в том числе и результатом взаимодействия используемых сред с маслом в текущих условиях культивирования.
Таким образом, показана важность предварительного тестирования/исследования коммерчески доступного мала, предназначенного для культивирования эмбрионов in vitro в лабораториях ЭКО, с целью повышения эффективности программ вспомогательных репродуктивных технологий в целом. Результатом таких исследований будет являться получение бóльшего количества эмбрионов хорошего качества, пригодных для переноса или витрификации, что позволит кумулятивно увеличить шанс наступления беременности в рамках программ ЭКО, а также снизить количество проводимых протоколов индукции суперовуляции у пациенток.
Заключение
Использование парафинового масла для покрытия капель со средой при культивировании эмбрионов in vitro повышает эффективность эмбриологического этапа по сравнению с использованием для тех же целей минерального масла.
