Большие акушерские синдромы – термин, предложенный в 2009 г. Roberto Romero и Gian Carlo Di Renzo [1], объединяющий такие осложнения беременности, как преждевременные роды, преждевременный разрыв плодных оболочек, преэклампсия, задержка роста плода и др. [2]. Согласно имеющимся данным, в основе патогенеза больших акушерских синдромов [3] лежит плацентарная недостаточность как результат адаптивного ответа материнско-плодового компартмента на патологические импульсы [3]. С помощью различных механизмов организм матери пытается защитить плод от неблагоприятных воздействий (например, при нарушении кровотока в сосудах матки и плаценты происходит компенсаторное повышение артериального давления у матери). Однако адаптивные реакции материнского организма могут привести к дисфункции многих органов и систем, возникновению неблагоприятных исходов у плода как в краткосрочном, так и в долгосрочном периодах. Перинатальное поражение центральной нервной системы (ЦНС) (внутрижелудочковое кровоизлияние, ишемия головного мозга) проявляется в последующем в виде различных неврологических расстройств; в частности, детский церебральный паралич, задержка физического и психомоторного развития, поведенческие расстройства и неспособность к обучению отмечаются почти у половины детей [4–6]. Тяжелые формы перинатальных поражений ЦНС наблюдаются у 1,5–10% доношенных и у 60–70% недоношенных детей. Увеличивается распространенность аутизма, синдрома дефицита внимания и гиперактивности, а также других нарушений нервного развития, потенциально имеющих внутриутробную этиологию. Воздействие химических веществ, лекарств, инфекций и, как следствие, возникновение воспаления или неблагоприятных условий питания может нарушить развитие головного мозга плода, истощает субпопуляцию нейронов и отрицательно влияет на формирование нормальных синаптических связей [7].
Внеклеточные везикулы открыты в 1967 г. английским исследователем Питером Вульфом. Они впервые верифицированы в плазме крови человека и получили исходное название «тромбоцитарная пыль». Установлено, что внеклеточные везикулы самостоятельно высвобождаются большинством живых клеток различных организмов (архей, прокариот и эукариот), и эволюционно процесс их высвобождения остается неизменным у всех организмов, то есть формирование этих структур характерно для различных типов клеток любого эволюционного уровня. Внеклеточные везикулы разделяют на три основных класса: экзосомы, апоптозные тельца и микровезикулы [8].
В последние десятилетия активно ведутся исследования по изучению и применению внеклеточных везикул в качестве биомаркеров различных патологических состояний, в том числе связанных с плацентарной дисфункцией [8–11]. Недавние открытия в области перинатальной медицины показали, что внеклеточные везикулы являются ключевыми молекулами, проникающими через плаценту и осуществляющими сигналинг между плодом и матерью. Их роль существенна в иммунологических, сосудистых реакциях и метаболической адаптации беременной к вынашиванию плода. Внеклеточные везикулы секретируются монослоем синцитиотрофобласта, покрывающим ворсинки хориона. И по мере увеличения гестационного срока их количество растет. При различных осложнениях беременности, в частности преэклампсии, гестационном сахарном диабете, преждевременных родах и задержке роста плода, их количество увеличивается по сравнению с физиологической беременностью [12]. В кровотоке матери внеклеточные везикулы могут быть обнаружены уже на ранних сроках беременности (˜6 недель) [9, 13]. При этом груз и биологическая активность внеклеточных везикул изменяются по мере развития дисфункции, что позволяет рассматривать их в качестве специфичных маркеров патологического течения беременности до появления клинических симптомов [8, 10, 13–19].
Внеклеточные везикулы весьма гетерогенны, что в значительной степени затрудняет характеристику их свойств и функций. По современным представлениям, основанным на биогенезе, внеклеточные везикулы являются гетерогенной популяцией мембранных пузырьков различного происхождения [20]. Экзосомы (диаметр 30–100 нм) образуются в виде внутрипросветных пузырьков в результате почкования эндосомальной мембраны внутрь и секретируются во время слияния мультивезикулярных эндосом с поверхностью клетки, тогда как микровезикулы (диаметр от 50 до 1000 нм) образуются путем формирования отростка (почкование) плазматической мембраны наружу и последующего высвобождения пузырьков во внеклеточное пространство [21, 22]. К популяции внеклеточных везикул также относят апоптотические тельца (диаметр >1000 нм), которые высвобождаются клетками, подвергшимися запрограммированной клеточной гибели (апоптозу) [23].
Доказано, что каждый тип клеток настраивает биогенез внеклеточных везикул в зависимости от физиологического или патологического состояния клетки и высвобождает их с определенным составом липидов, белков и нуклеиновых кислот [24]. Кроме того, природа и количество груза внеклеточных везикул зависят от типа и состояния донорской клетки, а также стимулов, модулирующих их выработку и секрецию [25]. Несмотря на то что образование микровезикул и экзосом происходит в разных компартментах клетки, в их биогенезе участвуют общие внутриклеточные механизмы сортировки, что во многих случаях является препятствием для возможности различать субпопуляции внеклеточных везикул [20].
Экзосомы содержат определенный груз, в частности белки, метаболиты, нуклеиновые кислоты и некодирующие виды РНК. Среди основных белков, включенных в экзосомы, представители семейства тетраспанинов (CD9, CD63, CD81 и CD82), участвующих в формировании экзосом и сортировке груза, эндосомального сортировочного комплекса (ESCRT), необходимого для транспортных белков (Alix, TSG101), интегрины, белки теплового шока (Hsp), актин и флотилины. Кроме того, экзосомы содержат липидные компоненты, из которых состоит их двуслойная мембрана, такие как сфингомиелин, холестерин и церамиды, также оказывающие влияние на сортировку груза, секрецию экзосом и передачу сигналов [23, 26, 27]. Помимо белков, в экзосомы избирательно упакованы микроРНК (мкРНК). Последние сортируются в экзосомах в зависимости от присутствия специфических мотивов в их последовательности, что указывает на зависимую регуляцию данного процесса [28].
Экзосомы секретируются различными типами клеток, включая макрофаги, раковые, дендритные и мезенхимальные стволовые клетки. Их присутствие в различных биологических жидкостях, таких как грудное молоко, кровь, сыворотка, моча, слюна, амниотическая и синовиальная жидкость, опосредует системно и локально межклеточную коммуникацию и обеспечивает внутриклеточную передачу сигналов [29, 30]. Небольшой размер и мембранный состав позволяют им преодолевать основные биологические мембраны, включая гематоэнцефалический барьер. Они обладают значительным терапевтическим потенциалом благодаря содержанию различного груза и способности доставлять его к клеткам-мишеням, воздействуя, таким образом, на разные сигнальные пути [31].
Оценка дисфункции головного мозга плода во время родов, обусловленной плацентарной недостаточностью, и новорожденного вскоре после рождения является одной из острейших проблем в перинатальной медицине [32, 33]. Основным препятствием на пути к выявлению механизмов и сроков манифестации нарушений нервно-психического развития является почти полное отсутствие чувствительных неинвазивных методов диагностики [7]. При этом магнитно-резонансную томографию и позитронно-эмиссионную томографию возможно использовать для исследования функции головного мозга плода, начиная с 18 недель беременности [34]. Кроме того, ограничениями исследований специфичных биомаркеров в периферической крови являются невозможность связать их уровни с патологией головного мозга, а также относительная неопределенность их тканевого происхождения [35].
Возможность получения экзосом из различных клеточных источников, в частности нейрональных, ознаменовала новый этап в изучении биомаркеров дисфункции головного мозга [36, 37]. Нейрональные экзосомы вовлечены в его развитие посредством регуляции пластичности нервной системы и морфологии клеток [38], в патогенез неврологических нарушений, а также процесс регенерации нейронов после травмы головного мозга путем усиления ремоделирования нейритов [39]. Недавние исследования показали, что экзосомы служат важным медиатором и регулятором нейротрансмиссии посредством изменения пресинаптической/постсинаптической передачи сигналов и контроля высвобождения нейротрансмиттеров [40–42]. Все основные типы нервных клеток, включая нейроны, микроглию, астроциты, олигодендроциты и нервные стволовые клетки, могут секретировать экзосомы и поглощать их [43]. Таким образом, коммуникация между нервными клетками посредством экзосом может регулировать различные физиологические процессы в ЦНС [35].
Помимо общих особенностей, экзосомы нейронального происхождения обладают некоторыми характеристиками в зависимости от их клеточного происхождения и содержат специфичные для нейронов маркеры, включая молекулу клеточной адгезии L1 (L1CAM) и субъединицы GluR2/3 глутаматных рецепторов [35]. Секреция экзосом была продемонстрирована как в развивающихся, так и в дифференцированных зрелых нейронах. Было показано, что на их высвобождение из высокодифференцированных нейронов влияют приток кальция и глутаматергическая синаптическая возбудимость [44]. Важной особенностью нейрональных экзосом является способность преодолевать гематоэнцефалический барьер двунаправленным образом, что позволяет рассматривать их применение в качестве «жидкостной биопсии» головного мозга [45].
Микроглия является первой линией защиты ЦНС от проникновения патогенов и повреждения головного мозга, участвует в иммунной регуляции, восстановлении и ремоделировании тканей для поддержания гомеостаза ЦНС [35]. Секреция экзосом микроглией тесно связана с инфекцией и нейровоспалением. А анализ содержания белка в этих экзосомах представил уникальные для них маркеры, в частности аминопептидазу CD13 и переносчик лактата MCT-1 [46]. Кроме того, астроциты, наиболее распространенный тип глиальных клеток, играющих важную регуляторную роль в контроле транспорта, активации иммунных клеток и поддержании гомеостаза головного мозга, также секретируют экзосомы, отличающиеся специфичными маркерами, включая глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP), транспортер глутамин-аспартата (GLAST) и глутаминсинтетазу (GLUL) [47]. Олигодендроциты, отвечающие за образование миелиновых оболочек на аксонах и обеспечивающие их поддержку [48], секретируют экзосомы, содержащие компоненты миелина, основной белок миелина (MBP), миелиновый олигодендроцитарный гликопротеин (MOG) и липиды миелина [49].
Экзосомы являются важными медиаторами плацента-опосредованных механизмов перинатального воспаления и повреждения головного мозга плода [50]. Содержащие уникальный паттерн активных молекул, они могут отражать степень дисфункции нервной системы плода во время беременности. Их способность стимулировать перекрестные помехи между матерью и плодом обеспечивает функциональные изменения и межклеточную передачу сигналов не только локально, но и в отдаленных органах, включая головной мозг. В одном из исследований были выделены экзосомальные маркеры из плодных оболочек на фоне воздействия медиаторов инфекции и воспаления для оценки риска преждевременных родов или разрыва плодных оболочек, оно показало наличие уникальной сигнатуры экзосомальных белков из разных типов клеток в ответ на различные стимулы [51]. Экзосомы вовлечены в нейровоспаление по оси «плацента-плод-головной мозг» [50]. Во время патологических состояний они могут перемещаться к нервным клеткам, ингибировать или нарушать регуляцию экспрессии специфических генов за счет содержания в них нейротоксического груза, в частности мкРНК, и способствовать, таким образом, перинатальному повреждению головного мозга плода [52]. Перемещенные экзосомы также могут индуцировать нейровоспаление путем стимуляции клеток-реципиентов к выработке провоспалительных цитокинов [53]. Локально активированные моноциты и макрофаги пересекают гематоэнцефалический барьер и секретируют экзосомы, которые поглощаются астроцитами, вызывая дисфункцию нейронов посредством высвобождения специфического груза [52]. В другом исследовании было показано, что экзосомы, секретируемые микроглией, подвергшейся воздействию воспалительных стимулов, сливаются с нейронами и трансфицируют мкРНК, приводя к изменениям синаптической структуры и уменьшению дендритных отростков [54]. Кроме того, пренатальное воздействие воспаления с использованием доклинической модели церебрального паралича привело к гиперреактивности иммунной системы, которая сохранялась во взрослом возрасте [55]. Вышеизложенное свидетельствует о том, что внутриутробное воспаление может способствовать не только нейровоспалению и острому повреждению головного мозга плода, но и приводить к устойчивым и долгосрочным изменениям в иммунном статусе у детей с неврологической дисфункцией, обусловленной плацентарной недостаточностью.
Первые данные о возможности получения внеклеточных везикул, обогащенных экзосомами нейронального происхождения, и доказательства того, что нейрональные экзосомы являются наиболее чувствительными и специфичными биомаркерами дисфункции головного мозга, были получены группой исследователей из США [56]. Было показано, что нейрональные экзосомы содержат более высокие уровни сигнальных молекул, вовлеченных в клеточный метаболизм, процессы репарации и регенерации. Кроме того, груз нейрональных экзосом может отражать дозозависимые реакции на лекарственную терапию, что может быть использовано для мониторинга и/или прогнозирования фармакологического ответа [57]. Предложенная учеными методология продемонстрировала хорошие диагностические и прогностические результаты при ряде нейродегенеративных заболеваний [35, 37, 47, 56, 58–60].
Успешное применение указанной технологии было позже продемонстрировано для получения нейрональных экзосом фетального происхождения из крови матери во время беременности [7, 61, 62]. Использование такого подхода открывает весьма привлекательную перспективу получения специфичных биомаркеров для патологий плода, связанных с неврологической дисфункцией, поскольку нейрональные экзосомы способны проникать через гематоэнцефалический барьер плода и плацентарный барьер в кровоток матери [43, 61, 63]. По данным Goetzl L. et al., 20% от общего количества нейрональных экзосом, выделенных из образцов плазмы крови матери в I и II триместрах беременности, состоят из везикул, секретируемых ЦНС плода [7]. Авторам, в частности, удалось получить данные везикулы с использованием антитела против Contactin-2, аксонального гликопротеина-1 (TAG-1), который временно экспрессируется на аксональной поверхности определенных нейронов в течение эмбрионального развития, для оценки неблагоприятных исходов развития нервной системы плода в результате воздействия этанола в I триместре [7, 61]. А дальнейший анализ нейрональных экзосом фетального происхождения показал, что экспрессия miR-9, ключевой мкРНК, участвующей в нейрогенезе, а также уровни ряда синаптических белков значительно снижены в связи с влиянием этанола во время беременности [61]. Наряду с этим, способность нейрональных экзосом пересекать гематоэнцефалический барьер двунаправленным образом позволяет использовать их нейропротекторные или нейрорегенеративные свойства с целью разработки и доставки лекарств для лечения перинатального повреждения головного мозга [64].
Заключение
Разработка технологии детекции фетальных нейрональных везикул в кровотоке матери в качестве платформы для «жидкостной биопсии» головного мозга плода открывает новые возможности по неинвазивному пренатальному мониторингу нарушений развития нервной системы и их потенциальной коррекции при плацента-ассоциированных заболеваниях. Усовершенствование алгоритма ведения беременности с помощью внедрения данных технологий позволит снизить риск повреждения головного мозга новорожденных и избежать возникновения отдаленных последствий неврологических нарушений во взрослом возрасте.
