Преэклампсия – это специфичное для беременности осложнение, характеризующееся гипертензией и протеинурией и в ряде случае полиорганной недостаточностью [1, 2]. Преэклампсия вносит значительный вклад в материнскую и неонатальную заболеваемость и смертность во всем мире [3].
Несмотря на длительную историю изучения этиологии и патогенеза данного осложнения беременности, остаются не вполне ясными возможности прогнозирования нарастания тяжести и перинатальных исходов [4, 5]. Клинические критерии постановки диагноза и установления степени тяжести, такие как наличие гипертензии, развившейся после 20-й недели гестации, уровень протеинурии, зачастую являются неспецифичными и неоднозначными [1, 2, 6]. Учитывая гетерогенность патогенеза, исследования в сфере поисков новых маркеров идут в разных областях. Существуют уже широко используемые в практике диагностические маркеры, например растворимая fms-подобная тирозинкиназа 1 (sFlt-1), плацентарный фактор роста (PlGF) и их соотношение, позволяющее с высокой точностью диагностировать преэклампсию [7, 8]. По мнению Sachan R. et al., диагностировать преэклампсию можно по уровню проангиогенного белка эндоглина (sEng) [9]. Кроме того, в исследованиях Karapetian А.О. et al. и Krasnyi A.M. et al. была изучена возможность прогнозирования преэклампсии на ранних сроках беременности по уровню внеклеточной фетальной ДНК [10, 11]. В работе Борис Д.А. была изучена возможность верификации степени тяжести преэклампсии по относительному содержанию классических CD16-негативных моноцитов в крови беременных [12].
Однако несмотря на внушительный спектр исследований в плане раннего прогнозирования преэклампсии и ее осложнений и дифференцировки тяжести остаются вопросы о сроках родоразрешения при нарастании тяжести преэклампсии, об оценке эффективности лечения и возможности прогнозирования перинатальных исходов [13–15]. В одной из последних работ, касающейся данных проблем, доказано, что высокие риски перинатальных осложнений имеют прямую корреляцию с нарастанием уровня общей внеклеточной ДНК в процессе лечения преэклампсии, что является неблагоприятным прогностическим критерием [11]. В работе Садековой А.А. и соавт. с целью выбора наиболее оптимальных сроков и методов родоразрешения для улучшения перинатальных исходов описана возможность использования количественного определения внеклеточной фетальной ДНК для выявления группы риска по развитию задержки роста плода у пациенток с преэклампсией [16].
Поскольку иммунологический аспект развития преэклампсии представляет наибольший интерес, продолжение исследований в данном направлении имеет высокую значимость. Ранее нами был проведен анализ уровней поверхностных маркеров, экспрессируемых мононуклеарными клетками периферической крови у пациенток с преэклампсией [17–20]. В ходе исследования было установлено, что при преэклампсии уровень экспрессии моноцитами CD152, CD86 и лимфоцитами CD28, а также содержание CD16+ моноцитов статистически значимо выше, чем в группе сравнения, что подтверждало их возможности в диагностике данного осложнения [21].
Принимая во внимание высокий диагностический потенциал вышеперечисленных поверхностных маркеров, изучение их в динамике течения преэклампсии может быть использовано для прогнозирования перинатальных исходов и оптимизации сроков родоразрешения.
Цель исследования: изучить изменение содержания CD16+ моноцитов, уровня экспрессии CD86, CD152 моноцитами и CD28 лимфоцитами в периферической крови в течение 5 дней у беременных с преэклампсией на фоне проводимой терапии. Определить факторы, имеющие прогностическую ценность для определения группы с осложнениями в неонатальном периоде.
Материалы и методы
Клинической и лабораторной базой для проведения исследования являлось ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» Минздрава России. Исследование включало 26 беременных с преэклампсией. Этический комитет одобрил проведение данной работы. Постановка диагноза проводилась согласно клиническим рекомендациям «Преэклампсия. Эклампсия. Отеки, протеинурия и гипертензивные расстройства во время беременности, в родах и послеродовом периоде» (2021) [1]. Отбор пациенток проводился по обращаемости в профильные отделения Центра. Для всех исследуемых пациенток были следующие критерии включения: одноплодная беременность, осложненная преэклампсией, в сроке 22–40 недель, стационарное лечение не менее 5 дней, подписанное добровольное информированное согласие на участие в исследовании. Критерии невключения: многоплодие, беременность, наступившая в результате экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), аутоиммунные, хромосомные, онкологические, острые воспалительные и инфекционные заболевания женщины, тяжелая экстрагенитальная патология. Критерии исключения: родоразрешение менее или более чем через 5 дней от момента госпитализации.
Так как все пациентки находились на стационарном лечении от 2 до 14 дней, то с целью динамического изучения поверхностных маркеров в периферической крови у беременных забор материала производился на 1, 2, 4, 5, 7, 10, 12 и 14-е сутки.
Непосредственно взятие материала проводилось по стандартизированной методике: производился забор крови у пациентки в пробирку с натрий-гепарином, после чего в течение 30 минут пробирку транспортировали в лабораторию. Для выделения мононуклеарных клеток в пробирку отбирали по 5 мкл крови, в которую добавлялось 45 мкл раствора PBS. На следующем этапе, согласно протоколу производителя, выполнялась обработка конъюгированными с флуоресцентными метками антителами.
Лейкоциты были анализированы на проточном цитофлуориметре (BD FACSCalibur, USA). Относительное содержание (%) моноцитов и лимфоцитов вычислялось как количество каждой популяции клеток к общему количеству моноцитов и лимфоцитов. Экспрессия иммунными клетками исследуемых факторов была оценена по уровню флуоресценции конъюгированных с флуоресцентными метками антител к изучаемым антигенам и представлена в виде интенсивности флуоресценции, отн. ед. (FI).
Статистический анализ
Статистический анализ проводился с использованием программы StatTech v. 4.3.3 (ООО «Статтех», Россия). Сравнение двух групп по количественному показателю выполнялось с помощью U-критерия Манна–Уитни, при этом количественные данные описывались с помощью медианы (Me) и нижнего и верхнего квартилей (Q1; Q3). Сравнение процентных долей выполнялось с помощью точного критерия Фишера, данные представлены в виде процентов (%). ROC-анализ был использован для определения прогностической ценности и определения оптимального порогового значения изучаемых факторов. Статистически значимыми различия между выборками считалась при значении p<0,05.
Результаты
Забор материала был произведен всего у 45 пациенток с преэклампсией. У большего количества пациенток родоразрешение было произведено на 5-е сутки после госпитализации (n=26). Таким образом, в исследование вошли 26 женщин, у которых были изучены поверхностные маркеры мононуклеарных клеток на 1-е и 5-е сутки. Кроме того, выбор пяти дней был обоснован тем, что длительности данного срока достаточно для проведения гипотензивной, магнезиальной терапии с целью нейропротекции плода, реализации действия дексаметазона для профилактики респираторного дистресса плода в сроках беременности до 34 недель. Всем пациенткам проводилась терапия согласно клиническим рекомендациям «Преэклампсия. Эклампсия. Отеки, протеинурия и гипертензивные расстройства во время беременности, в родах и послеродовом периоде» (2021) [1].
Ретроспективно на основании течения неонатального периода было сформировано 2 группы исследования: группа 1 (основная, n=10) – с осложненным и группа 2 (группа сравнения, n=16) – с неосложненным течением раннего неонатального периода. Клинико-анамнестические характеристики исследуемых пациенток представлены в таблице 1.
Было установлено, что гестационный срок пациенток, включенных в исследование, составил 32–37 недель беременности. Между основной и группой сравнения не было статистически значимых различий в возрасте, сроке беременности при родоразрешении, уровнях систолического и диастолического артериального давления, индексе массы тела. Также группы статистически значимо не различались по тяжести и сроку манифестации преэклампсии.
Как было указано выше, всем пациенткам проводилась гипотензивная терапия с учетом степени тяжести. Для нивелирования вмешивающегося фактора был проведен анализ терапии между исследуемыми группами. Профилактика низкими дозами аспирина в основной группе была у 3/10 женщин (30%), в группе сравнения – у 5/16 (31,3%), p=0,64. В основной группе проведение профилактики респираторного дистресс-синдрома плода было у 4/10 пациенток (40,0%), в группе сравнения – у 6/16 (37,5%), p=0,56; терапия низкомолекулярными гепаринами в основной группе проводилась всем 10/10 пациенткам (100%), в группе сравнения – 12/16 (75%), p=0,15. Выполненный анализ демонстрирует однородность проводимой терапии в группах, что снижает влияние данного конфаундера на конечные результаты исследования.
Была проанализирована гемодинамика в артериях пуповины, отражающая состояние плода, – пульсационный индекс в пупочной артерии. Отмечается, что в основной группе исследования, с осложненным ранним неонатальным периодом, пульсационный индекс был статистически значимо выше, чем в группе сравнения (p=0,047).
В группе с осложненным течением раннего неонатального периода самопроизвольные роды отмечались у 2 женщин, у 8 – кесарево сечение, показаниями послужили ухудшение состояния плода, тяжесть преэклампсии, отсутствие эффекта от проводимой терапии. В группе с неосложненным течением раннего неонатального периода родоразрешение через естественные родовые пути было произведено у 6 беременных, у 10 – путем операции кесарева сечения, показаниями являлись ухудшение состояния плода, нестабильная динамика на фоне преэклампсии и тяжелая ее форма.
Родились 26 детей, между исследуемыми группами баллы по шкале Апгар на 1-й и 5-й минутах имели статистически значимые различия. Группа с осложненным течением раннего неонатального периода включала такие осложнения, как асфиксия при рождении, респираторный дистресс-синдром, врожденная пневмония, синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания, геморрагический синдром, синдром угнетения функции центральной нервной системы плода. В группе сравнения в одном случае наблюдалась неонатальная желтуха новорожденного.
В каждой группе были изучены содержание CD16+ моноцитов, уровни экспрессии CD86, CD152 моноцитами и CD28 лимфоцитами в периферической крови беременных в первой и второй точках исследования, а также проанализировано динамическое изменение маркеров в исследуемых группах, с этой целью рассчитана разница между конечным и исходным уровнем. На рисунке 1, в таблицах 2 и 3 представлены результаты исследования.
Как видно из рисунка 1, в основной группе наблюдается тенденция к возрастанию уровней исследуемых маркеров, за исключением экспрессии лимфоцитами CD28. В группе сравнения все значения, кроме экспрессии лимфоцитами CD28, имеют тенденцию к снижению уровней в динамике исследования. Можно предположить, что нарастание исследуемых факторов, являющихся потенциальными маркерами преэклампсии, может коррелировать с ухудшением состояния плодов.
Сравнение динамических изменений в группах оказалось критически важным для определения пациентов с осложненным течением раннего неонатального периода. Сравнение изменения в динамике (Δ) изучаемых параметров между группами представлено в таблице 4 и на рисунке 2.
Установлено, что статистически значимое различие Δ отмечалось в содержании CD16+ моноцитов в периферической крови: в основной группе – 13,3 (10,9; 75,9)%, в группе сравнения – 0,95 (-6,55; 4,3)% (р<0,001); Δ для экспрессии СD86 и CD152 моноцитами между группами не имела статистически значимой разницы, однако наблюдалась тенденция к повышению. Это обосновывает целесообразность дальнейшего изучения данных факторов. С целью оценки прогностической ценности определения исходов беременности по Δ уровня содержания CD16+ моноцитов в периферической крови на фоне проводимой терапии в течение 5 дней был проведен ROC-анализ (рис. 3).
Установлено, что при пороговом значении относительного содержания CD16+ моноцитов, равном 5,7%, площадь под ROC-кривой составила 0,96. Чувствительность – 97%, специфичность – 75%. Прогностическая ценность положительного результата – 71%, прогностическая ценность отрицательного результата – 100%.
На основании повышения содержания CD16+ моноцитов в периферической крови беременных в течение 5 дней на фоне проводимого лечения на ≥5,7% можно прогнозировать развитие неблагоприятных перинатальных исходов с чувствительностью 97% и специфичностью 75%, и данный маркер может быть использован в качестве дополнительного критерия досрочного родоразрешения.
Полученные данные указывают на перспективность прогностического использования Δ содержания CD16+ моноцитов в периферической крови беременных с целью оценки успеха проводимой терапии, выбора сроков родоразрешения и прогнозирования перинатальных исходов.
Обсуждение
Предполагалось, что проводимая терапия, направленная на стабилизацию состояния пациентки, должна нормализовать показатели гемодинамики и способствовать снижению иммунного ответа, выраженного в экспрессии моноцитами CD16, CD152, CD86 и лимфоцитами CD28, реализующими провоспалительный ответ в организме беременной с преэклампсией [21]. Однако в нашей работе снижение исследуемых маркеров на фоне проводимого лечения наблюдалось только в части случаев. При этом их нарастание, в частности увеличение содержания CD16+ моноцитов, явилось неблагоприятным прогностическим критерием и ассоциировано с высоким риском перинатальных осложнений, что может подтверждать выраженную иммунную дисрегуляцию в организме беременной и чрезмерный воспалительный ответ.
Результаты данного исследования позволяют с высокой чувствительностью и специфичностью прогнозировать осложненное течение раннего неонатального периода, а выделенный маркер может быть использован в качестве дополнительного критерия досрочного родоразрешения. Помимо сильных сторон, необходимо признать ограничения. Обобщенность результатов нашего исследования ограничена небольшим размером выборки. Кроме того, мы не знаем, будут ли результаты статистически значимыми при изменении срока менее или более 5 дней до родоразрешения.
Заключение
Изучение содержания CD16+ моноцитов и экспрессии CD152 и CD86 моноцитами и CD28 лимфоцитами в периферической крови беременных с преэклампсией в динамике на фоне проводимой терапии получило важное практическое значение. В ходе работы было установлено, что нарастание уровней исследуемых маркеров, ассоциированных с иммунной дисрегуляцией при преэклампсии, на фоне лечения характеризует беременных с осложненным течением раннего неонатального периода. Полученные результаты указывают на перспективность прогностического использования изменения в динамике содержания CD16+ моноцитов в периферической крови беременных с целью прогнозирования перинатальных исходов и выбора сроков родоразрешения.
