Введение. В группе метаболических отклонений, приводящих к развитию мочекаменной болезни (МКБ), особое место занимает цистинурия. Нарушение обмена цистина представляет собой генетическую патологию с аутосомно-рециссивным типом наследования [1, 2]. В его основе лежит генетический дефект фермента, осуществляющего активную абсорбцию ряда аминокислот в кишечнике и их реабсорбцию в проксимальных канальцах почек из первичной мочи, что приводит к увеличению экскреции в конечную мочу цистина, лизина, орнитина и аргинина. Согласно данным литературы [1, 2], гиперсекреция трех последних аминокислот в развитии кристаллурии, нефролитиаза и нарушения функции почек особой роли не играет.

Избыточное накопление цистина в клетках почки может быть результатом генетического дефекта лизосомального фермента цистинредуктазы, восстанавливающего цистин в цистеин, с поражением почек, селезенки, костного мозга, нервной и мышечной ткани (цистиноз). Другим вариантом патологии является развитие цистинурии вследствие генетически обусловленного дефекта мембранного транспорта данной аминокислоты с нарушением обратного всасывания цистина в почечных канальцах.

В итоге определяющим фактором образования цистиновых мочевых камней рассматривается высокая экскреция цистина с мочой, которая может достигать 3200 мкмоль/cут. В силу плохой растворимости в водной среде цистин легко переходит в кристаллическое состояние. Формирование камней может начинаться в детстве, но пик заболеваемости приходится на второе и третье десятилетия жизни. Частота цистиновых камней у взрослых составляет менее 1%; у детей она выше – 2–3% случаев [2].

Цель исследования: определить референсные показатели суточной экскреции с мочой цистина, лизина и аргинина и их содержания в утренней моче относительно креатинина для диагностики нарушения метаболизма, приводящего к формированию мочевых камней.

Материалы и методы. Для определения референсных значений содержания в суточной и разовой утренней порциях мочи цистина, лизина и аргинина в 2014–2015 гг. обследованы 695 практически здоровых лиц (409 мужского пола и 286 женского) в возрасте 1–17 лет, проживающих на территории Республики Беларусь.

Кроме этого за 2012–2014 гг. в научно-исследовательской лаборатории Белорусской медицинской академии последипломного образования в процессе выполнения «метаболической диагностики» 1564 пациентам 7–45 лет с МКБ, проживающих в Минской области Республики Беларусь, изучена химическая структура мочевых камней.

Для выявления нарушений обмена цистина и цистиновых камней почек использован разработанный нами 3-этапный метод диагностики.

Этап 1-й. Качественная диагностика наличия цистина в моче. Осуществляется при помощи скринингового цистинового теста в капле мочи, где цистин восстанавливается в цистеин при помощи азида натрия. Свободные сульфгидрильные группы взаимодействуют с йодом, окрашиваясь в бурый цвет.

Этап 2-й. Количественный метод анализа мочи для оценки степени цистинурии. При положительном скрининговом тесте уровень цистина в моче (и сопутствующих его обмену аминокислот лизина, орнитина и аргинина) исследован методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с предколоночной дериватизацией аналитов на хроматографе жидкостном Agilent 1100 с системой градиентного элюирования, устройством автоматического ввода пробы, термостатом колонок и спектрофотометрическим детектором.

Этап 3-й. Диагностика цистиновых камней с использованием качественной химической реакции и микрокристаллоскопии. Камень очищают, промывают дистиллированной водой, высушивают на фильтровальной бумаге при комнатной температуре в течение 12 ч, взвешивают и описывают внешний вид. При наличии в образце нескольких визуально различимых фаз (в виде ядра, зональности и т.п.) отбирают фрагменты каждой фазы для микроскопии и химического анализа, согласно нижеприведенной процедуре. Образцы разрезают на части тонкой пилкой, измельчают и хранят в закрытых стеклянных пробирках (использование пластиковой посуды для хранения нежелательно по причине электризации порошка). При наличии хорошо сформированных кристаллов их отделяют иглой или шпателем для последующей микроскопии.

К препарату добавляют 5 мкл дистиллированной воды, через 1 мин накрывают покровным стеклом и микроскопируют (высыхание препарата недопустимо!). Цистин выпадает в виде характерных гексагональных кристаллов (см. рис., а), при дальнейшем росте образующих агрегаты.

Для обнаружения цистина к 5 мг порошка камня прибавляют 1 мл 10% HCl. Отбирают 1–3 мкл полученного раствора, который оставляют на предметном стекле до полного высыхания и затем микроскопируют. В присутствии цистина выпадают крупные игольчатые кристаллы цистина гидрохлорида (см. рис., б).

Статистическая обработка полученных данных, выполненная с использованием пакетов приложений Microsoft Office XP и программы Statistica (версия 6.0) с учетом вычислительных методов, рекомендованных для биологии и медицины, включила параметрические и непараметрические методы. Анализ статистической значимости различия показателей в сравниваемых группах осуществлен с помощью t-критерия Стьюдента.

Результаты

1. Формирование референса содержания цистина, лизина и аргинина в суточной и утренней моче

Референсные пределы уровня цистина, лизина и аргинина в возрастно-половом аспекте сформированы в выборке, представленной практически здоровыми лицами в возрасте 1–17 лет (n=695), с учетом основных положений инструктивных рекомендаций ГОСТа Р 53022.3-2008 [3].

Для выявления патологических отклонений содержания аналитов от значений, свойственных состоянию здоровья, сформирован референтный интервал, т.е. дисперсия значений аналитов, определенных в группе здоровых референтных индивидуумов и отобранных по специальным критериям. Обычно референтный интервал охватывает 95% всех референтных значений результатов лабораторных исследований, полученных в группе здоровых референтных индивидуумов.

Референтные пределы, ограничивающие референтные интервалы (верхний и нижний пределы референтного интервала), при 96%-ной вероятности обычно представляют собой 2,5-й и 97,5-й процентили (процентиль – выраженный в процентах р-квантиль, т.е. то значение переменной, ниже которого лежит р-доля распределения). Возможно применение других процентилей в качестве референтных пределов, что должно быть оговорено в условиях определения соответствующего референтного интервала. Нами для определения референтного интервала исследуемых субстанций использованы значения от 10-го до 90-го процентиля.

При формировании референтной группы отдельные данные оказались в стороне от основной массы числовых значений – результаты, «выпадающие из ряда» (outliers). Для проверки, действительно ли данное значение выпадает из ряда, нами применен критерий: «самое большое или самое маленькое значение может быть отброшено, если расстояние между ним и ближайшим в ряду значением превышает 1/3 всего ряда значений».

В итоге у лиц референтной популяции верхний и нижний пределы референтного интервала экскреции с мочой цистина, лизина, аргинина составили величины, представленные в табл. 1 и 2. Полученные данные позволили оценить статистическую значимость возрастно-половых различий изучаемых показателей. При тенденции к более высокому уровню аминокислот в моче у лиц женского пола статистически значимых различий в зависимости от пола не выявлено, что явилось основанием для формирования референсных показателей в возрастном аспекте без учета фактора пола.

1.1. Референсные значения показателей суточной экскреции с мочой цистина, лизина и аргинина

Как видно из табл. 1, количество цистина в биосубстрате с возрастом увеличивается: в среднем с 11,69±0,69 (м) и 9,75±0,65 (ж) у детей первого года жизни до 65,46±4,94 (м) и 99,36±5,23 (ж) мкмоль/сут у лиц 15–17 лет. Аналогичная динамика характерна для аргинина и лизина.

Оценка средних значений суточной экскреции с мочой цистина и сопутствующих ему аминокислот аргинина и лизина (табл. 1) показала статистически значимое (р<0,05) различие показателей у детей раннего возраста (до года и 1–3 лет) и обследованных в возрасте 11–14 и 15–17 лет. Достоверной разницы между группами «4–6» – «7–10 лет» и «11–14» – «15–17 лет» не выявлено, что дало нам основание их объединить. В то же время, несмотря на отсутствие статистически значимых различий в возрастных диапазонах «до 1 года» и «1–3 года», в силу специфики развития детей раннего возраста целесообразно рассматривать эти две группы раздельно. В итоге данные референса представлены в четырех возрастных группах: до 1 года, 1–3 года, 4–10 и 11–17 лет (табл. 3).

1.2. Референсные значения показателей содержания цистина, лизина и аргинина в утренней порции мочи

Оценка показателей содержания цистина и его «сателлитов» (аминокислот аргинина и лизина) относительно единицы экскреции креатинина в утренней порции мочи (табл. 2) выявила обратный по сравнению с суточной экскрецией характер возрастной динамики. Наиболее высокие значения цистина отмечены у детей до 1 года (у лиц обоего пола 11,21±1,44 и 11,28±1,60 отн. ед. при его снижении в возрасте 15–17 лет в 1,5–2,5 раза как у мужчин (4,24±0,58 отн. ед., так и у женщин (7,89±0,63 отн. ед.). Это обусловлено достоверным физиологическим ростом экскреции креатинина мочи с возрастом при высокой отрицательной корреляции показателя «цистин/креатинин» со значением креатинина (rs от –0,78 до –0,90).

Статистическая значимость различий содержания цистина в утренней порции мочи, определяемого относительно единицы экскреции креатинина (табл. 2), констатирована между возрастными группами «до 1 года» – «1–3 года» и «до 1 года» – «15–17 лет» (р<0,05). В возрастном промежутке 1–14 лет имела место близость значений изучаемых параметров. В итоге данные референса мы представили в трех возрастных группах: до 1 года, 1–14 и 15–17 лет (табл. 4).

Сравнение результатов собственных исследований с данными литературы показало соответствие величин рассматриваемых показателей в сопоставимых единицах и группах [4].

2. Частота встречаемости нарушения обмена цистина у некоторых категорий лиц, проживающих в Республике Беларусь

2.1. Распространенность нарушений обмена цистина у практически здоровых лиц 1–17 лет, проживающих в Республике Беларусь

По данным литературы, гиперцистинурия встречается в 2–12% случаев [2]. Нами выявлено соответственно разработанному референсу у лиц, считающихся практически здоровыми (n=695), превышение референсных значений цистина в 1,4% случаев, аргинина – у 2,9% обследованных, лизина – у 1,9%. Средние значения цистина и сопутствующих ему аминокислот аргинина и лизина в группе c гипераминоацдурией статистически значимо (р<0,001) превышали соответствующие параметры в контроле как при изучении суточной экскреции, так и по данным исследования утренней  порции мочи с пересчетом на единицу экскреции креатинина (табл. 5).

При клинической оценке результатов исследования мы исходили из того, что повышение в моче уровня аргинина и лизина в развитии кристаллурии, нефролитиаза и нарушения функции почек особой роли не играет: определяющим в механизмах формирования камней считается уровень цистина [1]. Как и при многих наследственных заболеваниях, нарушение метаболизма цистина может иметь легкую форму, когда его повышение в моче не достигает высокой степени, не сопровождается изменениями мочевого осадка и не приводит к образованию камней [1, 2]. В анализируемой выборке увеличение количества экскретируемых цистина, аргинина и лизина не сопровождалось клиническими симптомами и отклонением от нормы показателей общего анализа мочи. В итоге наличие повышенного уровня цистина в моче было расценено нами как выражение гиперцистинурии, свидетельствующей о необходимости динамического наблюдения за данной категорией обследованных, у которых в последующем может быть повышен риск формирования цистиновых камней в почках.

2.2. Частота встречаемости цистиновых камней по результатам исследования химической структуры уролитов у пациентов с МКБ

За 2012–2015 гг. в научно-исследовательскую лабораторию Белорусской медицинской академии последипломного образования для проведения «метаболической диагностики» обратились 1564 пациента 7–45 лет, страдающих МКБ. Цистиновые камни в данной выборке были выявлены в 0,8% случаев с колебанием уровня экскреции с мочой цистина в диапазоне 791–1080 мкмоль/сут. Наблюдался один случай семейной гиперцистинурии (отец, сын, дочь).

Заключение. Учитывая, что условием для образования цистиновых камней в мочевой системе является превышение физиологических значений его содержания в моче, констатации только наличия этой аминокислоты в моче методом качественной диагностики недостаточно. Для объективной оценки состояния метаболизма цистина с целью формирования группы риска развития цистинового нефролитиаза необходима оценка степени выраженности цистинурии. Разработанные в возрастном аспекте референсные значения суточной экскреции с мочой цистина и показателя индекса «цистин/креатинин» по данным исследования утренней порции мочи у лиц 1–17 лет дадут возможность определить состояние обмена аминокислоты на этапе формирования нарушений уже в раннем возрасте. Своевременное определение характера метаболических нарушений у конкретного пациента позволит разработать дифференцированную программу мероприятий по профилактике камнеобразования в почках.