Этиология лейомиомы матки (ЛМ) остается одной из нерешенных проблем современной медицины, что препятствует созданию эффективных алгоритмов медикаментозного лечения этого распространенного заболевания и сводит лечебные мероприятия к хирургическим пособиям. Частота ЛМ варьирует от 50% в репродуктивном возрасте до 70–80% среди женщин старше 50 лет. Существуют многочисленные концепции этиопатогенеза ЛМ с участием большого количества факторов, способствующих инициации и прогрессированию, как правило, множественных моноклональных пролифератов трансформированных гладкомышечных клеток шейки или тела матки, имеющих подслизистую, интрамуральную и/или субсерозную локализацию. Среди факторов этиопатогенеза ЛМ несомненны нарушения регуляции митотической активности миоцитов, изменения взаимодействий эстрогенов и прогестерона с их рецепторами, отклонения концентрации цитокинов, хемокинов, факторов роста и других сигнальных молекул, регулирующих ангиогенез, апоптоз и ремоделирование экстрацеллюлярного матрикса [1–3].
По-прежнему ведется поиск предикторов и триггеров миоматозного процесса у женщин в пределах одной или разных этнических групп, проживающих в аналогичных социальных и бытовых условиях. Большинство авторов указывают на генетическую предрасположенность как на один из ведущих факторов развития ЛМ. В одном из последних обзоров университета Джона Хопкинса (2024) приведены наиболее значимые из них: мутации гена MED12, гиперэкспрессия гена HMGA2, дефицит фумаратгидратазы (HLRCC) и цитогенетические аномалии. Важны и эпигенетические модификации, способствующие развитию ЛМ, такие как ацетилирование гистонов и метилирование ДНК. В частности, по сравнению с более дифференцированными клетками, стволовые клетки пациенток с ЛМ имеют уникальный паттерн метилирования ДНК. На популяционном уровне полногеномные исследования (GWAS) и эпидемиологический анализ выявили 23 генетических локуса, которые связаны с более молодым возрастом менархе и развитием ЛМ. Кроме того, различные GWAS исследовали генетические локусы как потенциальные факторы расовых различий в заболеваемости ЛМ [4]. В настоящее время результаты полногеномных исследований ЛМ, а также многочисленные работы, посвященные метатранскриптомике и метаметиломике ЛМ, практически не использованы для разработки новых диагностических методов и терапевтических средств [5, 6].
Цитокины как факторы регуляции клеточной жизнедеятельности также вносят весомый вклад в патогенез ЛМ [7, 8]. Реализация их регуляторных свойств зависит как от вариантности кодирующих последовательностей их генов, так и от количественных факторов, определяемых структурами некодирующих регуляторных фрагментов гена и эпигеномными факторами [9, 10].
Цель исследования: сравнительный анализ распределения однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) регуляторных участков ряда генов провоспалительных и противовоспалительных цитокинов у пациенток с ЛМ и практически здоровых российских женщин европеоидного происхождения, проживающих в Сибирском регионе Российской Федерации (РФ), с оценкой прогностической значимости выявленных генетических различий.
Материалы и методы
Выполнено генетическое и клиническое исследование 278 российских женщин европеоидного происхождения. Исследование носило наблюдательный характер по типу «случай–контроль» и включало 180 пациенток (основная группа) в возрасте 23–61 года (39,7 (6,5)) с наличием миоматозных узлов, визуализированных с помощью инструментальных методов исследования (D25 по МКБ-10) и верифицированных при последующем оперативном лечении и гистологическом исследовании. Всем 180 пациенткам в связи с полименореей и анемией (в половине наблюдений), а также по другим показаниям проведена плановая миомэктомия одиночных (68% случаев) или множественных (32% случаев) узлов. По классификации FIGO [11], у 82% пациенток доминировали узлы 4 и 5 типов (интрамуральные), у остальных 18% – субмукозные (1–2 типы по FIGO). Наиболее часто встречались узлы диаметром от 40 до 80 мм, на их долю приходилось до 51% от всех наблюдаемых вариантов размеров узлов. Среди сопутствующей патологии были отмечены хронический эндометрит, полипы эндометрия, внутриматочные синехии, гиперплазия эндоцервикса и гиперплазия эндометрия без атипии.
Контрольная группа формировалась из числа 98 практически здоровых женщин, сопоставимых по возрасту – от 22 лет до 61 года (34,0 (6,3)), без признаков ЛМ и других гинекологических заболеваний, которые обратились для комплексного обследования в рамках ежегодных осмотров.
Критерии исключения для обеих групп: беременность, сахарный диабет, острые воспалительные, острые инфекционные и аутоиммунные заболевания, а также отказ от подписания информированного согласия на участие в исследовании.
Клиническое исследование выполнено в соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения медицинских исследований с участием людей в качестве субъектов исследования» (64th WMA General Assembly, Fortaleza, Brazil, October 2013). Исследование одобрено Этическим комитетом НИИКЭЛ – филиал ФГБНУ «ФИЦ Институт цитологии и генетики СО РАН» (протокол № 115 от 24.12.2015 г.) и Этическим комитетом ФГБОУ ВО «Новосибирский государственный медицинский университет» МЗ РФ (протокол № 107 от 31.05.2018).
Генотипирование
Анализу подвергалась геномная ДНК человека, выделенная из лейкоцитов цельной крови с помощью тест-системы «ДНК-экспресс-кровь» (Litex, Россия). Генотипирование однонуклеотидного полиморфизма (single nucleotide polymorphism, SNP) фактора некроза опухоли (TNF)-863C/A, TNF-308G/A, TNF-238G/A, интерлейкина (IL)1B-31T/C, IL4-590C/T, IL6-174C/G, IL8-251T/A, IL10-592A/C, IL-10-1082A/G,
IL17-197A/G проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени с использованием интеркалирующего красителя SYBER GREEN (Litex, Россия) на амплификаторе «ДТ-96». С образцом выделенной ДНК параллельно проводились две реакции амплификации с двумя парами аллель-специфичных праймеров. Использовались готовые тесты от производителя; амплификация проводилась согласно инструкции производителя тест-систем. Тест-системы адаптированы производителем для амплификатора «ДТ-96» («ДНК-Технология», Россия). Результаты считались положительными, если значение FAM Ct было менее 27, и позволяли дать три типа заключения: гомозигота по аллели 1, гомозигота по аллели 2, гетерозигота. В случае гетерозиготы разница между Ct двух параллельных образцов не превышала 1,5 цикла. Анализ специфичности ампликонов и наличия перекрестных реакций между генотипами не проводился, поскольку использовались коммерческие тест-системы, и это должно было быть сделано производителем, гарантирующим качество и специфичность прохождения амплификации. Неспецифические сигналы (праймер-димеры, амплификация с неспецифических праймеров), согласно памятке производителя, выходили на 8–10 циклов позже специфических.
Статистический анализ
Обработку и статистический анализ результатов проводили с помощью многофункциональных программ – IBM SPSS Statistics 23, SNPstats и Arlequin 3.5 с использованием стандартных методов генетико-статистического анализа (расчет частоты встречаемости аллелей, отдельных генотипов и их комбинаций). Оценку силы ассоциации генов, генотипов и их комбинаций с ЛМ проводили по показателю OR (odds ratio) с расчетом 95% доверительного интервала (95% Confidence Interval). Для оценки прогностической ценности отдельных генотипов и их комбинаций рассчитывали такие биоинформационные показатели, как специфичность (Sp), предсказательная ценность положительного результата теста или вероятность развития заболевания у индивидуума с биомаркером (PPV), предсказательная ценность отрицательного результата теста или вероятность отсутствия заболевания у индивидуума без биомаркера (NPV) [12]. Данные по возрасту обследованных представлены в виде средних значений и стандартного отклонения в формате М (SD). Уровень значимости различий частот распределения генетических признаков в группах сравнения определяли по двустороннему критерию точного метода Фишера с учетом поправки Бонферрони, рассчитанной одношаговым методом [13]. Различия считали статистически значимыми при р<0,05. Частоты генотипов в группе здоровых женщин и пациенток находятся в равновесии Харди–Вайнберга.
Результаты
При исследовании особенностей распределения и структуры отдельных генотипов и полилокусных комбинаций 10 полиморфных позиций генов провоспалительных и противовоспалительных цитокинов были проанализированы 2402 комплексных генотипа, представленных комбинациями из 2–8 полиморфизмов генов цитокинов, 587 из которых оказались статистически значимыми после коррекции на множественные сравнения (поправка Бонферрони). Часть полилокусных комбинаций с наибольшей силой ассоциации с ЛМ представлены в таблице.
При сопоставлении частот встречаемости комбинированных генетических признаков в сравниваемых группах с наличием или отсутствием ЛМ выявлялись две группы показателей. Одна из этих групп с преимущественной частотой распространена среди пациенток с ЛМ (позитивные ассоциации с заболеванием в количестве 10 биомаркеров из 587), тогда как другая группа распространена лишь среди женщин с отсутствием клинических и инструментальных признаков ЛМ (негативные ассоциации с заболеванием в количестве 577 биомаркеров).
Доминирующими последовательностями в комбинациях, формирующих предрасположенность к развитию ЛМ, оказались 2- и 4-локусные высокоспецифичные генетические паттерны (10 генных цепей разной размерности), в частности [TNF-308; IL17-197 в позициях GG-AA] (OR=7,03, Sp=97,96%, p_cor=0,0162); [IL10-1082; IL17-197 в позициях AG-AA] (OR=10,78, Sp=98,98%, p_cor=0,0423); [TNF-308; IL6-174; L10-592; IL10-1082 в позициях GG-GC-CC-AG] (OR=12,81, Sp=98,98%, p_cor=0,0414).
У пациенток с ЛМ генетические комплексы различались с контрольной группой (таблица), и преобладали такие генетические комплексы, частота которых значительно снижена среди пациенток с ЛМ относительно контрольной группы. Это свидетельствует о том, что среди практически здоровых женщин преобладают комбинации SNP цитокиновых генов с протективным эффектом, т.е. связанных с устойчивостью к развитию ЛМ.
Среди этой группы признаков, которые можно условно отнести к группе «резистентных», число входящих в их состав SNP несколько шире, чем в группе признаков «предрасположенности». Среди них чаще встречались SNP хемокина IL-8 и полиморфизмы цитокинов с противовоспалительной активностью – IL-4 и IL-10 [IL6-174; IL8-251; IL10-592; IL10-1082 в позициях CC-TA-CC-AG] (OR=0,02, Sp=100,00%, p_cor=0,0062); [IL4-590; IL6-174; IL8-251; IL10-592; IL10-1082 в позициях CC-CC-TA-CC-AG] (OR=0,02, Sp=100,00%, p_cor=0,0107). Учитывая большое число биомаркеров резистентности, которые выявлялись в контрольной группе, можно вынести предварительное заключение об отсутствии у носителей данных композиций полиморфизмов как генетических факторов риска развития ЛМ.
Сортировка выявленных комплексных генетических признаков по величине позитивной и негативной сил ассоциаций с ЛМ позволила выявить группу высокоспецифичных комплексных генетических биомаркеров, положительная предсказательная ценность которых (PPV) достигает 100%. Так, например, комбинации из двух вариантов генов IL4-590, IL17-197 в позициях CC-AA или трех вариантов генов TNF-308, TNF-238, IL17-197 в позициях GG-GG-AA не только характерны для пациенток с ЛМ, но и не выявлены ни в одном случае в контрольной группе (Sp=100,0%, p_cor<0,05), что означает высокую прогностическую ценность данных биомаркеров в отношении развития ЛМ у конкретной пациентки.
С другой стороны, выявляется группа высокоспецифичных комплексных генетических признаков (Sp>98%), частота которых среди пациенток с ЛМ статистически значимо ниже, чем в контрольной группе. Выявление таких признаков у конкретной женщины позволяет отнести ее в группу условно резистентных к развитию ЛМ c вероятностью (PPV) от 87 до 100%. В этой же группе «резистентных» генетических комплексов относительно высока и предсказательная ценность отрицательного результата теста (NPV), т.е. вероятность отсутствия заболевания у субъекта без маркера достигает 71,31% (p_cor=0,0056).
Важно отметить, что относительно низкие значения показателя NPV в большинстве случаев обусловлены невысокой частотой встречаемости в популяции комплексных биомаркеров. Однако этот общий недостаток сложных генетических маркеров может быть компенсирован более широким их набором в прогностической матрице за счет поиска новых генетических композиций, патогенетически связанных с развитием ЛМ.
Обсуждение
В нашем исследовании представлен анализ результатов исследования 10 SNP генов цитокинов, которые, естественно, не охватывают весь цитокиновый геном, однако включают в себя наиболее изученные гены цитокинов с провоспалительной и противовоспалительной активностью.
При анализе полученных нами данных обращает на себя внимание широкое представительство во многих SNP-комбинациях вариантов гена TNF. Цитокин, кодируемый этим геном, участвует в развитии воспаления и апоптоза, играет важную роль в различных нарушениях иммунной системы и участвует как в развитии, так и в прогрессировании опухолевого роста. Имеются данные, что наличие генотипа TC и аллеля C в позиции -1031T/C (rs1799964) связано с предрасположенностью к ЛМ. Аллель C-1031T/C способствует повышенной транскрипции, экспрессии и продукции TNF-α [14], что может индуцировать пролиферацию миоцитов и развитие миоматозных узлов.
Наряду с этим часть исследованных цитокинов обладает и проангиогенной активностью, что является важным в формировании миоматозных узлов, увеличении мышечной массы матки при ЛМ, требующих роста кровеносной сети и активации неоангиогенеза и неоваскулогенеза. Такой активностью обладает IL-6, стимулирующий неоваскулогенез [15]. IL-8 (хемокин CXCL) также способен стимулировать ангиогенез путем индукции миграции и пролиферации CXCR2-экспрессирующих эндотелиальных клеток, обеспечивающих неоваскулогенез [16].
К настоящему времени описано несколько групп генов, варианты которых ассоциируются с предрасположенностью к развитию ЛМ. Среди них наибольшее внимание привлекают варианты генов TP53, p21, XRCC1, VDR, варианты генов транскрипционных факторов (гена MED12) и генов факторов роста (гена фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), IGF и TGF-β), генов стероидных рецепторов (эстрогенов и прогестерона), генов, участвующих в воспалении (интерлейкинов и TNF), а также варианты генов ремоделирования экстрацеллюлярного матрикса (MMP, TIMP) [17–19].
Полученные нами результаты близки к данным исследования группы российских женщин европейской части РФ, в котором показана значимая роль молекулярно-генетических маркеров генов IL-10 (rs1800872), IL-5 (rs2069812), IL-4 (rs2243250), IL-1B (rs16944) и IL-1A (rs1800587) в развитии ЛМ. Кроме того, эти данные подтверждают важность межлокусных взаимодействий в формировании предрасположенности к ЛМ [20].
Нами исследована популяция российских женщин европеоидного происхождения, проживающих в Сибирском регионе РФ, что важно ввиду высокой зависимости как распространения самого заболевания ЛМ, так и характера распределения частот генов цитокинов и их полиморфных вариантов от географических и этнических факторов [21, 22]. Эти зависимости, с одной стороны, затрудняют расширение полученных данных на всю группу пациенток, с другой – актуализируют разработку персонифицированных стратегий прогноза, ранней диагностики и лечения пациентов [23].
Заключение
Сравнительный анализ структуры генетических композитов позволил установить важное значение не столько отдельных полиморфизмов генов про- и противовоспалительных цитокинов, сколько их определенных композиций в патогенезе развития ЛМ, влияющих на процессы ремоделирования структуры внеклеточного матрикса, развитие фиброза, хронического воспаления и туморогенеза. На наш взгляд, необходимо продолжать накопление данных и их биоинформационный анализ для выявления высокоинформативных комплексов генетических показателей предрасположенности и резистентности к развитию ЛМ, что позволит персонифицировать предрасположенность значительной части пациентов к развитию этого социально значимого полигенного заболевания для проведения целенаправленных профилактических мероприятий.
