Цель исследования. Охарактеризовать влияние препарата ПростаНорм® на персистентный потенциал микроорганизмов, выделенных из секрета простаты больных хроническим бактериальным простатитом.
Материалы и методы. Опыты in vitro проведены на клинических изолятах из секрета простаты больных хроническим бактериальным простатитом: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, S. haemolyticus, S. epidermidis, Enterococcus faecalis. Влияние препарата ПростаНорм® (экстракт жидкий для приема внутрь) ООО НПО «ФармВИЛАР» (Россия) на антицитокиновую активность бактерий в отношении регуляторных цитокинов (IL4, IL6, IL8, TNFα и IL17А) определяли иммуноферментным методом; на антилизоцимный признак и способность формировать биопленки – фотометрическим методом.
Результаты. Выявлено однонаправленное ингибирующее действие препарата ПростаНорм® на антилизоцимную активность и способность микроорганизмов формировать биопленки. Установлено снижение экспрессии антицитокиновой активности (АЦА) в отношении IL17А и TNFα у всех изученных видов микроорганизмов, АЦА в отношении IL4, IL6, IL8 у E. coli и АЦА в отношении IL6 и IL8 у коагулазоотрицательных стафилококков.
Заключение. Способность ПростаНорма® однонаправленно снижать факторы персистенции условно-патогенных микроорганизмов в условиях in vitro является одним из возможных механизмов, подтверждающих выраженное простатотропное действие препарата, его бактериостатическую и противоспалительную активность.
Введение. Хронический бактериальный простатит (ХБП) является одним из распространенных заболеваний мужской репродуктивной системы. На его долю приходится от 5 до 10% от числа больных простатитом всех категорий [1]. Основными причинами возникновения ХБП являются инфекции и микроэкологические нарушения урогенитального тракта, а также цитокин-опосредованные механизмы воспаления предстательной железы [2]. Длительному персистированию микроорганизмов при простатите способствует их способность инактивировать лизоцим [3] и формировать биопленки [4]. Выявленные изменения антипептидной активности микробиоты в отношении цитокинов (TNFα, IL1РА, IL6, IL17) также могут вносить свой вклад в нарушение иммунного гомеостаза биотопа, приводя к формированию очага хронической инфекции [2]. Рядом авторов показано, что ингибирующим влиянием на персистентный потенциал микроорганизмов, в том числе возбудителей инфекционно-воспалительных заболеваний, характеризуются фитопрепараты [5, 6, 7]. В последние годы появилось множество сообщений о целесообразности применения растительных препаратов в комплексной терапии ХБП, в частности ПростаНорм®, терапевтические эффекты которого экспериментально подтверждены в многочисленных исследованиях в течение 20 лет [8–11]. Так, изучение в условиях in vitro антимикробной активности ПростаНорма® в отношении 56 клинических штаммов условно-патогенных микроорганизмов, выделенных от больных (Институт хирургии им. А.В. Вишневского и НИИ урологии РАМН), показало, что грамположительные бактерии рода Staphylococcus и Streptococcus (Enterococcus), играющих важную роль в этиологии инфекционно-воспалительных неспецифических заболеваний предстательной железы и мочевыводящих путей, проявляли высокую чувствительность к препарату. При этом активность ПростаНорма® в отношении лекарственно резистентных штаммов проявлялась в той же степени, что и в отношении антибиотикочувствительных штаммов бактерий [12].
Исследованием на базе ГБУЗ Московской области «Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского» (МОНИКИ) в условиях in vitro была установлена бактериостатическая активность ПростаНорма® в отношении грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов, а также бактерицидный эффект в отношении грамположительных микроорганизмов, выделенных от больных хроническим простатитом [11]. В результате другого исследования, установлена антибактериальная активность ПростаНорма® в отношении микроорганизмов, выделенных от пациентов с катетером-стентом мочеточника [13].
Вместе с тем, не охарактеризовано влияние ПростаНорма® на персистентные характеристики микроорганизмов, выделенных из секрета простаты больных хроническим бактериальным простатитом, что и явилось целью нашего исследования.
Материалы и методы. В работе исследован официнальный фитопрепарат ПростаНорм® (экстракт жидкий для приема внутрь) ООО НПО «ФармВИЛАР» (Россия), содержащий природные растительные компоненты травы зверобоя (Hypéricum perforátum), травы золотарника канадского (Solidágo canadénsis), корней солодки (Glycyrrhiza uralensis), корневищ и корней эхинацеи пурпурной (Echinácea purpúrea) и этанол 50% в качестве экстрагента. Клинические штаммы, выделенные из секрета простаты больных хроническим бактериальным простатитом: Escherichia coli (n=10), Staphylococcus aureus (n=10), S. haemolyticus (n=10), S. epidermidis (n=10), Enterococcus faecalis (n=10).
Видовую принадлежность микроорганизмов оценивали с помощью масс-спектрометра MALDI-TOF серии Microflex (Bruker Daltonics, Германия), идентификацию микроорганизмов с расчетом коэффициента достоверности проводили с использованием программного обеспечения Maldi BioTyper 3,0.
Влияние ПростаНорма® на персистентные свойства микроорганизмов изучали с помощью оригинальной методики, заключающейся в сокультивировании 1 мл микробной взвеси в физиологическом растворе с 1 мл фитопрепарата ПростаНорм® в 2 мл питательного бульона при 37°С в течение 2 часов. В качестве первого контроля использовали взвесь микроорганизмов без препарата, в качестве второго – взвесь микроорганизмов с добавлением 1 мл 50% раствора этилового спирта. Затем контрольные и опытные пробы центрифугировали в течение 15 мин при 3000 об/мин, сливали надосадочную жидкость, добавляли к осадку 2 мл питательного бульона, ресуспензировали. Далее отбирали по 150 мкл взвеси для определения антилизоцимной и антицитокиновой активности, способности формировать биопленки.
Способность образовывать биопленки (БПО) определяли по [14], антилизоцимную активность (АЛА) микроорганизмов – по [15]. Антицитокиновую активность (АЦА) в отношении IL4, IL6, IL8, TNFα и IL17А определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) по известной методике [16] с использованием наборов ООО «Цитокин» (Санкт-Петербург). В центрифужные пробирки вносили по 150 мкл взвеси микроорганизмов и растворы соответствующих цитокинов в соотношении 1:1, пробы инкубировали в течение 2 часов при 37 °С. После инкубации реакцию останавливали на холоде, пробы центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 мин (+4°С) и отбирали супернатанты.
Определение концентрации цитокинов в опытных и контрольных пробах проводили методом ИФА, результаты учитывали на фотометре StatFax 2100 (США) при длине волны 450 нм. Для определения антицитокиновой активности использовали растворы цитокинов в физиологическом растворе в следующих концентрациях: IL4 – 30,7 пг/мл, IL6 – 83,3 пг/мл, IL8– 83,3 пг/мл, TNFα– 52,3 пг/мл и IL17А– 461,5 пг/мл. Для оценки АЦА вычисляли процент инактивации цитокинов в опыте относительно контроля и выражали в % инактивации.
Эффект регуляции факторов персистенции микроорганизмов являлся существенным, если под воздействием ПростаНорма® происходило снижение их уровня на 40-60% и более, умеренный ингибирующий эффект регистрировался при снижении экспрессии факторов персистенции на 20-40% [17].
Статистический анализ результатов проводился с помощью пакета программ Microsoft Excel 2007. Значимость различий средних величин показателей оценивали с помощью методов вариационной статистики (t-критерий Стьюдента). Статистически значимыми отличия считали при p<0,05.
Результаты. В ходе проведенных исследований установлено выраженное однонаправленное ингибирующее действие ПростаНорма® как на распространенность, так и выраженность АЛА условно-патогенных микроорганизмов и их способности формировать биопленки.
Так, установлена потеря способности инактивировать лизоцим у половины изученных штаммов коагулазонегативных стафилококков (S. haemolyticus и S. epidermidis) и E. faecalis; 30% культур E. coli и S. aureus.
При этом под действием ПростаНорма® отмечено максимальное подавление АЛА у штаммов стафилококков: на 72% у S. haemolyticus, на 80,9% у S. epidermidis и на 81,5% у S. aureus (p<0,001). В меньшей степени (на 65,9%) ПростаНорм® ингибировал способность к инактивации лизоцима у E. faecalis (p<0,001), умеренный ингибирующий эффект признака (на 28,3%) регистрировался у кишечной палочки (таблица 1).
Способность формировать биопленки была утрачена у 100 % изолятов S. haemolyticus, 50 % штаммов S. aureus, S. epidermidis и E. faecalis, а также 30% культур E. coli. Под действием ПростаНорма® отмечено снижение БПО у остальных изученных культур стафилококков разных видов и энтерококков в среднем на 15%, а у изолятов E. coli на 30% .
Анализ распространенности антицитокиновой активности микроорганизмов показал подавление АЦА в отношении IL6 у 20% изолятов E. coli, 50% S. epidermidis и всех изученных культур S. haemolyticus.
Установлено разнонаправленное влияние ПростаНорма® на способность клинических штаммов инактивировать цитокины IL4, IL6, IL8. Препарат ПростаНорм® достоверно не изменял выраженность АЦА культур коагулазоотрицательных стафилококков и энтерококков в отношении противовоспалительного IL4; E. faecalis в отношении IL6 и IL8, S.aureus в отношении IL8.
Вместе с тем, максимальное подавление (на 58%) АЦА в отношении IL6 под действием ПростаНорма® отмечено у эпидермального стафилококка, на 38% снизилась выраженность АЦА в отношении IL8 у S. epidermidis и S. haemolyticus (p<0,001).
При этом ПростаНорм® оказывал однонаправленное ингибирующее действие на АЦА в отношении IL17А и TNFα у всех изученных микроорганизмов.
У S. aureus выявлено достоверное снижение АЦА в отношении IL17А и TNFα на 63% и 84% (p<0,01), у S. haemolyticus – на 32% и 46% (p<0,001), у S. epidermidis на 46% и 38% (p<0,001) соответственно, умеренный ингибирующий эффект активности отмечен у E. faecalis – на 27% и 40% (p<0,01).
Также умеренный ингибирующий эффект (на 27–29%) ПростаНорм® оказывал на выраженность антицитокиновой активности в отношении IL4, IL8, TNFα у изолятов E. coli и существенный (44%) на АЦА в отношении IL17А у данного вида бактерий.
Обсуждение. В результате проведенного исследования получены новые сведения о модифицирующем действии ПростаНорма® на персистентные свойства микроорганизмов, выделенных из секрета простаты больных хроническим бактериальным простатитом.
Факторы персистенции микроорганизмов, в частности, биопленкообразование и антилизоцимная активность, являются биомишенью для изучения и подбора препаратов, пригодных для борьбы с патогенами [18]. В эксперименте in vitro нами установлено однонаправленное ингибирующее действие препарата ПростаНорм® на АЛА и БПО всех изученных видов условно-патогенных микроорганизмов.
В настоящее время активно изучается антицитокиновая активность микроорганизмов. Показано ее наличие у стафилококков разных видов, выделенных из секрета предстательной железы у мужчин с симптомами урогенитальной инфекции [19], разработан алгоритм прогнозирования риска развития послеоперационных воспалительных осложнений с использованием данных о распространенности и выраженности АЦА у кишечных палочек, выделенных у больных с урогенитальной патологией [20], выявлены отличия в значениях АЦА микроорганизмов, выделенных при различных формах инфекционного процесса [21]. Кроме того, предложено использование антипептидной активности микробиоты в совокупности с цитокиновым профилем хозяина в качестве биомишени для диагностических, профилактических и лечебных мероприятий при ХБП [2].
В связи с этим, представляют несомненный интерес полученные нами в ходе исследования данные о модификации препаратом ПростаНорм® антицитокиновой активности, заключающейся в снижении экспрессии АЦА в отношении IL17А и TNFα у всех изученных видов микроорганизмов, АЦА в отношении IL4, IL6, IL8 у E. coli и АЦА в отношении IL6 и IL8 у коагулазоотрицательных стафилококков.
Заключение. Полученные материалы позволяют объяснить один из возможных механизмов фармакологической активности ПростаНорма® in vivo его способностью однонаправленно снижать изученные факторы персистенции условно-патогенных микроорганизмов в условиях in vitro.
1. Bozhedomov V.A. Chronic prostatitis: a new treatment paradigm. Urologiia. 2016;3:78–90. Russian (Божедомов В.А. Хронический простатит: новая парадигма лечения. Урология. 2016;3:78–90).
2. Buharin O.V., Kuz’min M.D., Perunova N.B., Ivanova E.V., Bekpergenova A.V., Bondarenko T.A. Characteristics of microbiota and cytokine profile of spermoplasm in patients with chronic bacterial prostatitis. Urologiia. 2020;5:67–72. Russian (Бухарин О.В., Кузьмин М.Д., Перунова Н.Б., Иванова Е.В., Бекпергенова А.В., Бондаренко Т.А. Характеристика микробиоты и цитокинового профиля спермоплазмы у больных хроническим бактериальным простатитом. Урология. 2020;5:67–72). Doi: 10.18565/urology.2020.5.67-72.
3. Naboka Yu.L., Kogan M.I., CHernickaya M.L., Gudima I.A. Ibishev H.S., Ferzauli A.H. Microbial spectrum of prostate secretion and persistence factors of bacteria found in chronic bacterial prostatitis. Byulleten’ Orenburgskogo nauchnogo centra Uro RAN. 2012;3:2–6. Russian (Набока Ю.Л., Коган М.И., Черницкая М.Л., Гудима И.А. Ибишев Х.С., Ферзаули А.Х. Микробный спектр секрета предстательной железы и факторы персистенции бактерий, обнаруженных при хроническом бактериальном простатите. Бюллетень Оренбургского научного центра Уро РАН. 2012;3:2–6). http://elmag.uran.ru:9673/magazine/Numbers/2012-3%20/Articles/10Naboka.pdf.
4. Kartashova O.L., Pashinina O.A., Pashkova T.M., Gricenko V.A., Mihajlenko S.V. Bioprofiles of various types of staphylococci isolated from prostate secretions in men with chronic bacterial prostatitis. Tihookeanskij medicinskij zhurnal. 2023;1:5–9. Russian (Карташова О.Л., Пашинина О.А., Пашкова Т.М., Гриценко В.А., Михайленко С.В. Биопрофили стафилококков разных видов, выделенных из секрета предстательной железы у мужчин с хроническим бактериальным простатитом. Тихоокеанский медицинский журнал. 2023;1:5–9).
5. Buharin O.V., CHelpachenko O.E., Perunova N.B., Ivanova E.V., Andryushchenko S.V. Experimental and clinical substantiation of the choice of antimycotic phytopreparations. Vestnik Orenburgskogo Gosudarstvennogo Universiteta . 2015;3(178):183–191. Russian (Бухарин О.В., Челпаченко О.Е., Перунова Н.Б., Иванова Е.В., Андрющенко С.В. Экспериментально-клиническое обоснование выбора антимикотических фитопрепаратов. Вестник Оренбургского Государственного Университета. 2015;3(178):183–191).
6. Kartashova O.L., Utkina T.M., ZHestkov A.V., Kurkin V.A., Zolotarev P.N. Influence of phytosubstances with antioxidant activity on persistent properties of microorganisms. Antibiotiki i himioterapiya. 2009;54(9–10):16–18. Russian (Карташова О.Л., Уткина Т.М., Жестков А.В., Куркин В.А., Золотарев П.Н. Влияние фитосубстанций, обладающих антиоксидантной активностью, на персистентные свойства микроорганизмов. Антибиотики и химиотерапия. 2009;54(9-10):16–18).
7. Kartashova O.L., Utkina T.M., Popova L.P. Regulation of anti-lysocim activity of microorganisms and their ability to form biofilms by essential oils of medicinal plants. Vestnik Orenburgskogo Gosudarstvennogo Universiteta. 2014;13(174):45–49. Russian (Карташова О.Л., Уткина Т.М., Попова Л.П. Регуляция антилизоциной активности микроорганизмов и их способности образовывать биопленки эфирными маслами лекарственных растений. Вестник Оренбургского Государственного Университета. 2014;13 (174):45–49).
8. Sitdykova M.E., Perchatkin V.A. Experience with the use of prostanorm in the treatment of patients with chronic prostatitis. Kazanskij medicinskij zhurnal. 2002;83(4):305–306. Russian (Ситдыкова М.Э., Перчаткин В.А. Опыт применения препарата простанорма в лечении больных хроническим простатитом. Казанский медицинский журнал. 2002;83(4):305–306).
9. Segal A.S., Kolhir V.K., Voskobojnikova I.V., Trumpe T.E., Dolgopyatov D.G. Generalization of experience in the treatment of chronic prostatitis with the domestic drug prostanorm. Effektivnaya farmakoterapiya. 2011;43:6–9. Russian (Сегал А.С., Колхир В.К., Воскобойникова И.В., Трумпе Т.Е., Долгопятов Д.Г. Обобщение опыта лечения хронического простатита отечественным препаратом простанорм. Эффективная фармакотерапия. 2011;43:6–9).
10. Voskobojnikova I.V., Trumpe T.E., Kolhir V.K., Segal A.S. Prostanorm is a modern effective drug for the treatment and prevention of chronic prostatitis. Sibirskij Konsilium. 2006;2(49):24. Russian (Воскобойникова И.В., Трумпе Т.Е., Колхир В.К., Сегал А.С. Простанорм – современное эффективное лекарственное средство для лечения и профилактики хронического простатита. Сибирский Консилиум. 2006; 2(49):24).
11. Rusanova E.V., VasilenkoI.A., Gur’ev A.S., Voskobojnikova A.K., Fomina N.A., Voskobojnikova I.V., Kolhir V.K. Investigation of antimicrobial properties of ProstaNorm drug on uropathogens isolated from clinical material of patients with chronic prostatitis. Andrologiya i genital’naya hirurgiya. 2017;18(3):69–76. Russian (Русанова Е.В., Василенко И.А., Гурьев А.С., Воскобойникова А.К., Фомина Н.А., Воскобойникова И.В., Колхир В.К. Исследование антимикробных свойств препарата ПростаНорм на уропатогенах, выделенных из клинического материала больных хроническим простатитом. Андрология и генитальная хирургия. 2017;18(3):69–76). Doi: https://doi.org/10.17650/2070-9781-2017-18-3-69-76.
12. Voskobojnikova I.V., Kolhir V.K., Krutikova N.M., Trumpe T.E. New in the treatment of chronic bacterial prostatitis. Aktual’nye voprosy infekcionnoj patologii v urologii i ginekologii. Tez.konf. 2007;18–21 (Воскобойникова И.В., Колхир В.К., Крутикова Н.М., Трумпе Т.Е. Новое в лечении хронического бактериального простатита. Актуальные вопросы инфекционной патологии в урологии и гинекологии. Тез .конф. 2007;18–21).
13. Rusanova E.V., Vasilenko I.A., Bychkova N.V., Erofeev S.B., Shchelkova V.V., Voskobojnikova A.K., Kolhir V.K. Prostanorm: application and effectiveness of use in patients with a ureteral catheter-stent. Clinical nephrology. 2022;3:77–82 (Русанова Е.В., Василенко И.А., Бычкова Н.В., Ерофеев С.Б., Щелкова В.В., Воскобойникова А.К., Колхир В.К. Простанорм: применение и эффективность использования у пациентов с катетером-стентом мочеточника. Клиническая нефрология. 2022;3:77–82). https:/dx.doi.org/10/18565/nefrology.2022.3.77-82
14. O’Toole G., Kaplan N.V., Kolter R. Biofilm formation as microbial development. Annual Review of Microbiology. 2000; 54:49–79.
15. Buharin O.V. Persistence of pathogenic bacteria. M.: Medicina; 1999. 365 p. (Бухарин О.В. Персистенция патогенных бактерий. М.: Медицина; 1999: 365 c.)
16. Buharin O.V., Perunova N.B., CHajnikova I.N., Ivanova E.V., Smolyagin A.I. Anticytokine activity of microorganisms. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii. 2011;4:56–61. Russian (Бухарин О.В., Перунова Н.Б., Чайникова И.Н., Иванова Е.В., Смолягин А.И. Антицитокиновая активность микроорганизмов. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2011;4:56–61).
17. Buharin O.V., Usvyacov B.YA., SHeenkov N.V. Characteristics of the antilysozyme activity of Staphylococcus aureus in various types of experimental infection. Byulleten’ ekperimental’noj biologii i mediciny. 1993;2:178–180. Russian (Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я., Шеенков Н.В. Характеристика антилизоцимной активности золотистого стафилококка при различных типах течения экспериментальной инфекции. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1993;2:178–180).
18. Sidorova O.I., Ivanova E.V., Perunova N.B. Anti-lysozyme activity and biofilm formation of bifidobacteria under stress. Vestnik Orenburgskogo gosudarstvennogo universiteta. 2014;13:100–103. Russian (Сидорова О.И., Иванова Е.В., Перунова Н.Б. Антилизоцимная активность и биопленкообразование бифидобактерий при стрессорном воздействии. Вестник Оренбургского государственного университета. 2014;13:100–103).
19. Kartashova O.L., Pashkova T.M., Pashinina O.A., Morozova N.V. Anti-cytokine activity and ability to produce cytokine-like substances of staphylococci isolated from prostate secretions in men with symptoms of urogenital infection. Rossijskij immunologicheskij zhurnal. 2021;24(2):257–260). Russian (Карташова О.Л., Пашкова Т.М., Пашинина О.А., Морозова Н.В. Антицитокиновая активность и способность к продукции цитокиноподобных веществ стафилококков, выделенных из секрета предстательной железы у мужчин с симптомами урогенитальной инфекции. Российский иммунологический журнал. 2021;24(2):257–260). Doi: 10.46235/1028-7221-995-AAA.
20. Pashkova T.M., Morozova N.V., Mavzyutov A.R., Kuz’min M.D., Kartashova O.L., Gricenko V.A. Characterization of the pathogenic potential of Escherichia coli isolated from patients with calculous pyelonephritis. Urologiia. 2021;4:19–24. Russian (Пашкова Т.М., Морозова Н.В., Мавзютов А.Р., Кузьмин М.Д., Карташова О.Л., Гриценко В.А. Характеристика патогенного потенциала Escherichia coli, выделенных от больных с калькулезным пиелонефритом. Урология. 2021;4:19–24). Doi: https://dx.doi.org/10.18565/urology.2021.4.19-24.
21. Popova L.P., Pashkova T.M., Morozova N.V., Kuz’min M.D, Kartashova O.L. Anticytokine activity of E. coli strains isolated from patients with urolithiasis. Rossijskij immunologicheskij zhurnal. 2019;13(2-1(22)):474–476. Russian (Попова Л.П., Пашкова Т.М., Морозова Н.В., Кузьмин М.Д, Карташова О.Л. Антицитокиновая активность штаммов E. coli, выделенных у больных мочекаменной болезнью. Российский иммунологический журнал. 2019;13(2-1(22)): 474–476). Doi: 10.31857/S102872210006935-3.
22. Ministry of Health of the Russian Federation Instructions for the medical use of the drug ProstaNorm®. Russian (Министерство Здравоохранения РФ Инструкция по медицинскому применению лекарственного препарата ПростаНорм®).
А в т о р д л я с в я з и: М. Д. Кузьмин – д.м.н., врач-уролог высшей квалификационной категории, ведущий научный сотрудник лаборатории по изучению механизмов формирования микробных биоценозов человека ИКВС УрО РАН – обособленного структурного подразделения Федерального государственного бюджетного учреждения науки ОФИЦ УрО РАН, Оренбург; e-mail:
