Введение. Значительный технологический прогресс в удалении камней с помощью эндоурологических, дистанционных, консервативных и других методов позволяет избавлять пациентов от абсолютного большинства конкрементов, находящихся в любом отделе мочевыделительной систем [1]. При этом удаление конкрементов не гарантирует в дальнейшем отсутствие рецидива мочекаменной болезни (МКБ), так как оперативное вмешательство направлено на устранение клинических проявлений данного заболевания и не влияет на патогенетические аспекты [2]. В большинстве случаев пациенты после выписки получают неопределенные рекомендации относительно дальнейшего течения МКБ, лечения возможных осложнений (растительные препараты, водная нагрузка) и профилактики рецидивов, что, как правило, спустя несколько месяцев или лет снова приводит этих пациентов в приемное отделение с жалобами, характерными для МКБ [4]. Лечение МКБ должно быть комплексным, патогенетически обоснованным и помимо устранения камней быть направленным на обеспечение как можно более длительного периода безрецидивного течения.
Такие субстанции, как бикунин, остеопонтин и нефрокальцин, могут быть использованы в качестве маркеров рецидива кальций-оксалатного уролитиаза.
Бикунин – это белок, который относится к классу протеаз, в почках экспрессирующийся в переходно-клеточном эпителии при повышении активности процессов кристаллизации в мочевыводящих путях.
Остеопонтин – многофункциональный гликофосфопротеин, занимающий важное место в процессах реконструкции костной ткани, участвующий в продукции цитокинов, регулировании клеточной миграции, адгезии и дифференциации различных клеток [9, 10], в том числе макрофагов, эндотелиоцитов, гладкомышечных клеток, лимфоцитов и фибробластов, а также проявляющий про- и антивоспалительные качества. Имеются данные, согласно которым остеопонтин служит основным компонентом органического матрикса кальций-оксалатных конкрементов. Его концентрация в моче уменьшается при увеличении активности процессов кристаллизации, так как остеопонтин при этом расходуется на образование камней.
В настоящее время изучена роль оксидативного стресса в процессе уролитиаза. Наиболее очевидный вариант патогенеза рецидивных камней заключается в том, что повышение концентрации кальция и оксалатов в моче приводит к активации ренин-ангиотензин-альдостероновой системы (РААС) [6]. При этом происходит увеличение экспрессии NADPH-оксидазы в клетках переходно-клеточного эпителия, что в свою очередь приводит к повышению активности перекисного окисления липидов путем увеличения концентрации активных форм кислорода (ROS).
Высокая активность свободных радикалов в зонах, ответственных за камнеобразование, приводит к повреждению мембран почечного эпителия и увеличению экспрессии модуляторов кристаллообразования (белок Тамма–Хорсфалла, остеопонтин и др.) [7]. Кальций и оксалат накапливаются, затем осаждаются в присутствии мембранных фрагментов, адсорбируясь на зоны повреждения эпителиальных клеток в районе почечных сосочков. Результатом указанных механизмов служит формирование прикрепленных к переходно-клеточному эпителию почечных камней. В свою очередь антиоксиданты играют важную роль в предотвращении образования камней и защищают мембраны от повреждений [9]. Профилактика рецидива уролитиаза – актуальная проблема современной урологии. Сегодня ведутся многие исследования, целью которых является поиск лекарственных средств, которые могут быть использованы в профилактике рецидива МКБ. Целью же нашей работы стала оценка антиоксидантных свойств БАД Нефрадоз, а также оценка его роли в профилактике рецидива кальций-оксалатного уролитиаза.
Материалы и методы. Данное исследование состояло из двух частей. В экспериментальной части были оценены антиоксидантные свойства БАД Нефрадоз, в клинической части изучена эффективность Нефрадоза в лечении пациентов с рецидивирующим кальций-оксалатным уролитиазом.
Нефрадоз зарегистрирован на территории РФ как БАД и является комплексным растительным препаратом, позволяющим предупреждать процессы камнеобразования и улучшать качество жизни пациентов с МКБ. В состав Нефрадоза входят экстракт корней марены красильной, экстракт листьев ортосифона, экстракт травы эпимедиума (горянка), экстракт корней родиолы розовой, экстракт корней солодки, ресвератрол, экстракт листьев гинкго билоба, т.е. травы, оказывающие уросептическое, спазмолитическое, диуретическое и антиоксидантное действия.
Антиоксидантную активность препарата определяли методом активированной хемилюминесценции в системе генерации свободных радикалов 2,2’-азобис(2-амидинопропан) дигидрохлорида (АБАП, «Sigma») в присутствии активатора хемилюминесценции люминола («Sigma»). Методика основана на определении площади «провала» после добавления антиоксиданта к системе.
В качестве стандарта для определения антиоксидантной активности использовали тролокс-2,5,7,8-тетраметил-2(2’-карбоксиэтил)-6-гидроксихроман, производное витамина Е («Sigma»), активность которого условно принимали за единицу, а антиоксидантную активность исследуемого вещества выражали в эквивалентных молях тролокса на массу образца – стандартизованные единицы (Trolox equivalent antioxidant capacit, нмоль/л или мкмоль/капсула). В качестве вещества сравнения также был использован ресвератрол — природное фенольное стилбеноидное соединение с мощной антиоксидантной активностью («Sigma») [11].
В случае использования тролокса кривая периода индукции наиболее информативна, а также точно известно время, по истечении которого люминесценция возрастает, достигая практически первоначального уровня. Тролокс реагирует со свободными радикалами в соотношении 1:1, а период его индукции прямо пропорционален количеству, поэтому данное соединение может служить эталоном антиоксидантного ответа.
Исходный раствор тролокса концентрацией 100 ммоль/л готовили в метаноле (ос.ч, Sigma), рабочие растворы готовили растворением исходных растворов в дистиллированной воде. Рабочий раствор ресвератрола концентрацией 48 мМ готовили растворением навески в ацетоне. Раствор люминола (1 мМ) и раствор АБАП (50 мМ) готовили растворением навески в буферном растворе (100 мМ КН2РО4, рН 7,4).
Органический экстракт Нефрадоза получали следующим образом: содержимое капсулы массой 300 мг смешивали с 1 мл ацетона (>99%, «Sigma») и экстрагировали при встряхивании при 1400 об/с, далее отделяли супернатант после центрифугирования при 5000 g на центрифуге Eppendorf Minispin (США). Рабочие растворы готовили разбавлением исходного раствора ацетоном.
Измерения проводили на хемилюминометре Lum-1200 («ДИСофт», Россия), регистрацию и обработку сигнала осуществляли с помощью программного продукта PowerGraph 3.0.
В основу клинической части исследования положены результаты обследования и лечения 80 пациентов с МКБ, обратившихся в приемное отделение ГКБ № 31 ДЗМ и МНОЦ МГУ им. М. В. Ломоносова с 2017 по август 2018 г. Пациентам проводили комплексное урологическое обследование, включая спектроскопию конкремента.
В исследование были включены мужчины и женщины старше 18 лет, имевшие рецидивирующее течение МКБ (больше 1 рецидива в анамнезе). Под рецидивом имеется в виду либо клиническая манифестация МКБ (почечная колика), либо обнаружение новых конкрементов с помощью инструментальных методов исследования (компьютерная томография, УЗИ). У этих пациентов кальций-оксалатный характер уролитиаза подтвержден методом спектроскопии конкремента. Пациенты с вторичными формами МКБ (первичный гиперпаратиреоз, вторичный уролитиаз на фоне синдрома мальабсорбции) в исследование не включали.
Основную группу составили 45 пациентов, получавших Нефрадоз по 1 капсуле 2 раза в день во время еды как добавку к ежедневному пищевому рациону. В контрольную группу вошли 35 пациентов, которым противорецидивная терапия не назначалась. Период наблюдения за группами составил 6 мес., контрольное обследование проводили каждые 3 мес.
В рамках контрольного обследования все пациенты проходили комплексное урологическое обследование, включившее Литос-тест, определение концентрации маркеров МКБ (бикунин, остеопонтин) в моче и определение суточной концентрации ионов кальция и оксалатов. Некоторые пациенты, которым до обращения в клинику не проводили спектроскопию камня, выполняли анализ камня для определения его состава.
Выведение кальция больше 4 мг/кг в день трактовали как гиперкальциурию, оксалата кальция больше 40 мг/день – как гипероксалурию [5].
Полученные результаты обрабатывали в таблицах программы Microsoft Office Exсel (2008). Достоверность изменения концентрации ионов суточной мочи и концентрации маркеров камнеобразования в разовой порции мочи определялась также с помощью парного t-теста. Критическое значение α ошибки было принято за 0,05.
Результаты. Экспериментальная часть исследования. Градуировочную зависимость строили, как по тролоксу, общепринятому стандартному соединению [3], которое реагирует со свободными радикалами в соотношении 1:1. Форма аналитического сигнала и градуировочная зависимость по тролоксу приведены на рис. 1.
Уравнение градуировочного графика: S=2,16 c+3,82, R²=0,9773. Хемилюминограммы (см. рис. 1, а) типичны для индивидуальных сильных антиоксидантов или их смесей, для ресвератрола как антиоксиданта средней силы характерны кривые другого вида (рис. 2).
Хемилюминограмма ацетонового экстракта БАД Нефрадоз приведена на рис. 3.
Площадь «провала» S линейно зависит от концентрации Нефрадоза: S=46,55c–4,25; R²=0,972.
Антиоксидантная активность Нефрадоза определяется прежде всего содержащимся в нем ресвератролом и подобными по антиоксидантной активности ресвератролу компонентами. Это убедительно подтверждается экспериментально полученными хемилюминесцентными кривыми (аналогичные кинетика и аналитические параметры, характеризующие развитие кинетики хемилюминесценции, см. рис. 4).
По данным градуировочного графика (см. рис. 1, б) можно рассчитать антиоксидантную активность суммы антиоксидантов в капсуле (табл. 1).
Сравним активность 1 капсулы Нефрадоза и концентрации ресвератрола из расчета 10 мг (столько ресвератрола содержится в 1 капсуле препарата): при растворении 10 мг ресвератрола в 1 мл ацетона получен раствор с концентрацией вещества 44 мМ. Антиоксидантная активность данной концентрации ресвератрола оценивается в 19 мкМ в единицах тролокса, активность 1 капсулы Нефрадоза (300 мг) несколько выше – 23,66±1,18 мкМ в единицах тролокса (добавочный антиоксидантный эффект других растительных компонентов препарата).
Таким образом, Нефрадоз в терапевтических концентрациях обладает доказанной антиоксидантной активностью, 1 капсула Нефрадоза имеет антиоксидантную активность, равную 23,7 мкМ тролоксового эквивалента.
Клиническая часть исследования
Как видно из табл. 2, концентрация бикунина и остеопонтина на фоне приема Нефрадоза достоверно не изменилась (p>0,05). Результаты Литос-теста указывают на эффективность Нефрадоза в уменьшении активности МКБ. Количество пациентов с нулевой степенью активности камнеобразования в процессе лечения статистически значимо увеличилось с 31 до 42 (t-критерий Стьюдента 4,31>1,992 при степени свободы 78; р<0,05, рис. 5).
В процессе исследования мы также измеряли суточную концентрацию оксалатов и кальция в суточной моче. По результатам исследования не было выявлено достоверных изменений суточного количества оксалатов и кальция на фоне как приема Нефрадоза, так и наблюдения (см. табл. 2, 3).
Обсуждение. Как показали результаты экспериментальной части исследования, антиоксидантная активность Нефрадоза определяется ресвератролом, содержащимся в препарате, и подобными по антиоксидантной активности ресвератролу компонентами, поскольку кинетические кривые Нефрадоза и ресвератрола схожи. Такого рода кривые характерны для природных антиоксидантов средней силы [3]; кинетические константы перехвата свободных радикалов таких антиоксидантов составляют порядка единицы. Для количественной оценки можно применить тролоксовый эквивалент – активность антиоксиданта, выраженная в концентрационных единицах тролокса. Этот показатель лежит в основе теста ORAC (Oxygen radical absorbance capacity), который используют для оценки и сравнения антиоксидантных свойств в объектах сложного состава, таких как растительные препараты. Антиоксидантный эффект БАД Нефрадоз можно считать обоснованным и доказанным. С учетом того что активность свободных радикалов является предположительно одним из важнейших патогенетических факторов рецидивного камнеобразования [8], использование при терапии мочекаменной болезни вспомогательного эффекта ресвератрола как одного из компонентов БАД может компенсировать дисфункцию локальных антиоксидантных систем. Одним из механизмов, объясняющих снижение активности камнеобразования в контексте антиоксидантной активности БАД Нефрадоз, служит снижение экспрессии промоутеров агрегации кристаллов на поверхности переходно-клеточного эпителия. Показано, что 1 капсула Нефрадоза имеет антиоксидантную активность, равную 23,7 мкМ тролоксового эквивалента, что позволяет БАД оказывать поддерживающее компенсаторное и корригирующее действия при локальной дисфункции антиоксидантных систем. Вышеперечисленные эффекты увеличивают длительность ремиссии при образовании конкрементов.
Снижение активности камнеобразования при приеме Нефрадоза, по-видимому, связано в том числе с антиоксидантной активностью препарата – со снижением концентрации свободных радикалов в переходно-клеточном эпителии, что опосредует снижение экспрессии промоутеров кристаллизации в проекции бляшек Рэндалла.
Оксидативный стресс служит важным отягчающим компонентом камнеобразования прежде всего из-за наличия нескольких фармакологических мишеней в данном механизме [8]. Антиоксидантная активность не исключена у некоторых лекарственных препаратов, таких как ингибиторы АПФ, витамин Е и др., однако эффективность их действия должна быть проверена в дальнейших исследованиях.
В нашем исследовании не было показано достоверного изменения концентрации оксалатов и кальция в суточной моче, а также достоверных изменений концентрации бикунина и остеопонтина. Суточная экскреция кальция и оксалатов главным образом зависит от уровня функциональности и экспрессии кальциевых канальцев, через которые происходит реабсорбция кальция. При наследственных формах уролитиаза вследствие генетических дефектов нарушается реабсорбция кальция, который откладывается в интерстиции почки, формируя бляшки Рэндалла. На данный момент существует только одна группа препаратов, способных влиять на концентрацию кальция в моче, в частности тиазидные диуретики.
В свою очередь суточная экскреция кальция может повышаться при изменениях диеты, увеличении всасывания в кишечнике щавелевой кислоты (при заболеваниях ЖКТ либо эндогенном дефиците пиридоксина), повышенном мембранолизе – разрушении клеточных стенок при аутоиммунных, аллергических, системных воспалительных заболеваниях и др. Нефрадоз не показал значимого влияния на изменение концентрации оксалатов и кальция в суточной моче, но Нефрадоз ввиду своих антиоксидантных, диуретических, антисептических свойств способен снижать активность камнеобразования, препятствуя развитию рецидивов. Концентрация остеопонтина и бикунина также достоверно не изменялась на протяжении исследования. Обе молекулы могут экспрессироваться в мочевыводящих путях. Концентрация ингибитора протеиназы бикунина может повышаться в моче при повышении активности камнеобразования [13].
Концентрация остеопонтина в моче уменьшается при рецидивирующем камнеобразовании, так как остеопонтин расходуется на формирование органического матрикса конкрементов. Тем не менее уровень остеопонтина в моче зависит от ряда факторов, включая уровень потребления мяса и полиненасыщенных жирных кислот (положительная корреляция), концентрацию креатинина в сыворотке, индекс массы тела и окружность бедер [12].
В нашем исследовании мы наблюдали снижение активности камнеобразования до нуля у большинства пациентов с кальций-оксалатным уролитиазом, предположительно за счет антиоксидантной активности препарата, имеющей неоспоримое значение при данной разновидности МКБ, однако отсутствие изменения концентрации маркеров может свидетельствовать о том, что оксидативный стресс играет независимую роль в патогенезе уролитиаза, не ассоциированного с концентрацией остеопонтина и бикунина.
Заключение. Прием БАД Нефрадоз в качестве патогенетически обоснованного способа снижения рецидивной активности камнеобразования пациентами с кальций-оксалатным уролитиазом приводит к достоверному уменьшению активности МКБ, при этом максимальный эффект регистрируется через 3–6 мес. применения. Антиоксидантная активность определяется прежде всего ресвератролом и другими, подобными ему по характеру антиоксидантной активности компонентами препарата, которые, компенсируя локальную активность свободных радикалов, увеличивают вероятность длительной ремиссии МКБ.
Таким образом, БАД Нефрадоз служит средством, которое может быть использовано для профилактики рецидива кальций-оксалатного нефролитиаза.
