Введение. В современном обществе от 14 до 20% супружеских пар репродуктивного возраста страдают бесплодием [1–3]. На долю мужского бесплодия приходится около 40% бесплодных браков [4, 5]. В 30–50% случаев причиной мужской инфертильности служат генетические факторы [3, 6–9]. Генетический механизм возникновения различных форм репродуктивных нарушений весьма сложен, поскольку в его основе лежат различные комбинации аллельных вариантов множества генов, под контролем которых находятся процессы деления первичных половых клеток гоноцитов, протекающие еще в эмбриогенезе, дифференцировка сперматогониев, активно делящихся во время полового созревания, а также образование сперматоцитов, которые дважды претерпевают деление во время мейоза [6, 8]. Наиболее подходящим генетическим маркером для исследований являются полиморфные варианты генов биотрансформации ксенобиотиков, экспрессия которых, в отличие от других классов генов, непосредственно регулируется влиянием средовых факторов химической природы [10–15]. Ген GSTP1 (глутатионтрансфераза класса p-1) кодирует аминокислотную последовательность фермента p-1 глутатион-S-трансферазы, которая содержится в эритроцитах и участвует в метаболизме ксенобиотиков посредством присоединения глутатиона к субстратам. Полиморфизм I105V (A>G) гена GSTP1 связан с заменой нуклеотида аденина (А) на гуанин (G), что приводит к замене аминокислоты в пептидной цепи молекулы фермента, вызывая снижение его активности и, следовательно, накопление в организме токсичных веществ [12, 15].
В патогенезе заболеваний органов репродуктивной системы существенное значение имеют неспецифические процессы, протекающие на клеточном уровне [16, 17]. Процессам перекисного окисления липидов (ПОЛ) придают большое значение в нарушении жизнедеятельности клеток и молекулярных механизмов, что связано с образованием активных форм кислорода (АФК), нарушающих структуру и функцию мембран [16–18]. В избыточном количестве АФК могут инициировать патологические изменения в сперматозоидах путем индукции оксидативного повреждения клеточных липидов, протеинов и ДНК, что является одним из механизмов патогенеза мужского бесплодия. Активные формы кислорода оказывают негативное влияние даже в пределах физиологических концентраций, поскольку способны стимулировать преждевременную капацитацию и такие необратимые процессы, как акросомная реакция [18–20]. Аномалии сперматогенеза часто сопровождаются нарушением деятельности тиолзависимых ансамблей [21, 22]. При патоспермии имеет место снижение активности таких антиоксидантных ферментов, как глутатионпероксидаза (GPO), глутатион-S-трансфераза (GST), и уменьшение содержания восстановленного глутатиона (GSH) в спермиях и семенной плазме [23–25].
Целью исследования было установить ассоциацию двух полиморфных локусов Ile105Val, Ala114Val гена GSTP1 с параметрами окислительного стресса у мужчин с бесплодием.
Материалы и методы. Основную группу исследования составили 160 русских мужчин (средний возраст – 30,2±3,6 года), обратившихся в ГАУЗ «Республиканский перинатальный центр» МЗ РБ, Улан-Удэ, с проблемой бесплодия в браке. Диагноз бесплодия ставили, согласно рекомендациям ВОЗ (2010), на основании данных анамнеза, клинического осмотра, результатов гормонального исследования, микроскопии и полимеразной цепной реакции (ПЦР) соскоба из уретры, двукратного определения спермограммы с минимальным интервалом 2 недели, анализа секрета простаты, УЗИ половых органов. Контрольную группу составили 104 практически здоровых русских добровольца с реализованной репродуктивной функцией и нормозооспермией (средний возраст – 31,3±5,4 года). Из исследования были исключены мужчины, имевшие в анамнезе инфекции, передающиеся половым путем, ожирение, сахарный диабет 1-го и 2-го типов, артериальную гипертонию 1-й и 2-й степеней, воспалительные заболевания урогенитального тракта, генетические аномалии (AZF-делеции, CFTR-мутации, мутационные изменения числа CAG-повторов, контролируемые андрогеновыми рецепторами (AR)), эндокринное бесплодие.
Работа проведена в соответствии с этическими принципами, предъявляемыми Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации (последний пересмотр – 2013 г., Форталеза, Бразилия).
Молекулярно-генетическое исследование полиморфизмов Ile105Val (rs1695), Ala114Val (rs1138272) гена GSTP1 проводили с помощью метода ПЦР в режиме реального времени. Материалом для исследования служили пробы ДНК, полученные из образцов цельной венозной крови, забор которой осуществляли из локтевой вены в пробирки с антикоагулянтом ЭДТА-К3. Для экстракции ДНК использовали наборы реагентов АмплиПрайм ДНК-сорб-В (ООО «НекстБио», Россия). Амплификацию специфичных участков ДНК проводили на амплификаторе нуклеиновых кислот ДТ-Прайм («ДНК-Технология», Россия) с использованием тест-систем «Набор реагентов для определения полиморфизма Ile105Val гена GSTP1 (rs1695)» и «Набор реагентов для определения полиморфизма Ala114Val гена GSTP1 (rs1138272)» («Синтол», Россия). Интенсивность ПОЛ в сыворотке крови и эякуляте оценивали по уровню диеновых конъюгатов (ДК) по методу В. Б. Гаврилова и соавт. (1983), содержанию активных продуктов тиобарбитуровой кислоты методом В. Б. Гаврилова и соавт. (1987), α-токоферола и ретинола методом Р. Ч. Черняускене и соавт. (1984), общей антиокислительной активности (АОА) по методу Г. И. Клебанова и соавт. (1988). Концентрацию GSH и окисленного глутатиона (GSSG) определяли по методу P. Y. Hissin (1976). Активность GST, GPO и глутатионредуктазы (GR) оценивали по методу А. И. Карпищенко (2002), супероксиддисмутазы (СОД) – методом H. P. Misra, I. Fridovich (1972). Регистрацию оптических плотностей и флуоресценции проводили на спектрофотофлуориметре ВТS-350 (Испания), спектрофотометре СФ-2000 (Россия) и флюорате 02 АБФФ-Т (Россия).
Статистическую обработку данных проводили с использованием программы Biostat и STATISTICA, версия 6.1 («StatSoft Inc.», США (правообладатель лицензии – ФГБНУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека»)). Для описания количественных признаков использовали среднее (μ) и стандартное отклонения (σ). При анализе частотного распределения изученных полиморфизмов фактическую частоту генотипов проверяли на соответствие частотам аллелей, исходя из закона генетического равновесия Харди–Вайнберга. При сравнении частот генотипов между группами исследования использовали критерий χ². Нулевую гипотезу об отсутствии статистически значимых отличий отклоняли при уровне значимости 5%.
Результаты. Анализ показателей встречаемости полиморфизма Ile105Val гена GSTР1 у мужчин с бесплодием и фертильных мужчин выявил статистически значимые различия (χ2=7,487; р=0,024; см. таблицу).
Мужчины контрольной группы с доказанной фертильностью имели гомозиготный генотип Ile105Ile в 54% случаев, в то время как у мужчин с бесплодием данный генотип наблюдался в 67% случаев. Гетерозиготный генотип Ilе105Val в группе фертильных пациентов встречался чаще, чем у мужчин с бесплодием (33 и 28% соответственно).
В то же время фертильные пациенты оказались носителями мутантного генотипа Val105Val (14%) в 2,8 раза чаще, чем мужчины с бесплодием (5%).
При сравнении распределения частот генотипов полиморфизма Ala114Val гена GSTР1 у мужчин с бесплодием и фертильных пациентов достоверных различий выявлено не было (χ2=3,823; р=0,14). Гетерозиготные генотипы встречались в группе мужчин с бесплодием в 21,7% случаев, в группе фертильных мужчин – в 13%. Генотип Val114Val был обнаружен у двух пациентов с бесплодием и у одного фертильного мужчины. Доля носителей мутантного аллеля Val/Val составила 1% в группе мужчин как с бесплодием, так и фертильных мужчин.
Следующим этапом были изучены параметры ПОЛ и антиоксидантной защиты в крови и эякуляте фертильных и инфертильных мужчин, носителей гетерозиготных полиморфизмов, поскольку в данном случае аминокислотные замены находятся в активном центре фермента и приводят к значительному снижению его функциональной активности. У инфертильных мужчин, носителей гетерозиготного полиморфизма GSTP1(Ile105Val), установлены ассоциации исследуемого гена с повышением активности GSH на 7% (р=0,0004) и снижением GR на 20% (р=0,03) в сыворотке крови и снижением активности СОД на 8% (р=0,01) в эякуляте, в отличие от фертильных мужчин, носителей гетерозиготного полиморфизма GSTP1(Ile105Val), у которых установлены ассоциации с повышением общей АОА сыворотки крови на 20% (р=0,0001) и со снижением активности GPO на 24% (р=0,03) в эякуляте (рис. 1).
У мужчин с бесплодием, носителей гетерозиготного полиморфизма GSTP1(Ala114Val), установлены ассоциации исследуемого гена со снижением концентрации α-токоферола на 15% (p=0,002), повышением активности GPO на 25% (р=0,0004) в крови и снижением активности СОД на 7% (р=0,01) в эякуляте, в отличие от фертильных мужчин, носителей гетерозиготного полиморфизма GSTP1(AIa114Val), у которых установлены ассоциации с повышением концентрации ДК крови на 19% (р=0,0001) и со снижением активности GST на 32% (р=0,03) в эякуляте (рис. 2).
Обсуждение. Глутатион-S-трансферазы (GSTs) составляют группу ферментов, катализирующих детоксикацию широкого диапазона электрофильных субстратов и играющих существенную роль во второй фазе биотрансформации ксенобиотиков. Детоксикация достигается соединением ксенобиотиков с глутатионом, который облегчает нейтрализацию их электрофильного центра группой SH. Глутатион-S-трансферазы участвуют в защите клеток не только от токсичных ксенобиотиков, но и от цитотоксического воздействия активных форм кислорода [8, 12, 15]. Исследования последних лет свидетельствуют о том, что GSTs вовлечены в патогенез различных заболеваний, однако данные о влиянии полиморфизма генов системы биотрансформации на бесплодие весьма противоречивы [11, 15, 26, 27]. Одни авторы не находят связи между полиморфизмом Ile105Val гена GSTP1 и риском бесплодия, другие продемонстрировали риск бесплодия для генотипа Ile105Val [6, 7, 8, 27, 28]. Наши исследования показали, что полиморфизм Ile105Val гена GSTP1 может вносить вклад в формирование репродуктивных нарушений у мужчин. Единичные данные о функционировании глутатионовой системы сперматозоидов указывают на значимость данной системы в реализации таких патологических состояний, как патоспермия (астенозооспермия, олигозооспермия, тератозооспермия), секреторные и экскреторно-токсические виды бесплодия [4, 12, 23, 25]. В проведенном нами исследовании повышенный уровень общей АОА крови и сниженная активность GPO в эякуляте свидетельствуют о том, что в группе фертильных мужчин, носителей гетерозиготного полиморфизма GSTP1(Ile105Val), антиоксидантная защита реализуется уже на первых этапах блокирования пероксидации в ответ на активацию процессов ПОЛ.
У мужчин с бесплодием, носителей гетерозиготного полиморфизма GSTP1(Ile105Val), основной эффект GSH реализуется посредством участия в работе антиоксидантных ферментов. Являясь для них субстратом, GSH выступает донором атомов водорода для перекисей [20]. СОД выполняет не только защитную, но и регуляторную функцию, являясь ключевым звеном регуляции постоянной концентрации кислорода [29]. Снижение активности СОД в эякуляте инфертильных мужчин, носителей гетерозиготного полиморфизма GSTP1(Ile105Val), уменьшает инактивацию супероксидного радикала, что приводит к нарастанию степени окислительного стресса. Снижение активности GR в крови инфертильных мужчин, носителей гетерозиготного полиморфизма GSTP1(Ile105Val), вероятно, связано с активным участием фермента в процессе биорегенерации GSSG. Снижение мощности ферментативного звена антиоксидантной защиты, в частности одного из компонентов тиолдисульфидной системы, которая может не справляться с процессами окислительной модификации липидов, тем самым способствуя усилению процессов липопероксидации, свидетельствует о развитии оксидативного стресса.
Альфа-токоферол выполняет несколько функций, в совокупности обусловливающих антиоксидантный эффект. Так, взаимодействуя с гидроксильным радикалом ОН, он оказывает подавляющее влияние на синглентный кислород. Являясь ловушкой радикалов, α-токоферол активно участвует в блокировке процессов липопероксидации, а повышение его концентрации, возможно, связано с избыточным образованием свободных радикалов в процессе ПОЛ [29]. Снижение концентрации α-токоферола в крови мужчин с бесплодием, носителей гетерозиготного полиморфизма GSTP1(AIa114Val), происходит за счет его активного участия в метаболических реакциях. Глутатиопероксидаза эффективно взаимодействует с гидроперекисями фосфотидилхолина, холестерина и эфира холестерина, а также способна восстанавливать гидроперекиси фосфолипидов [16, 26]. Известно, что совместно с токоферолом GPO практически полностью подавляет ПОЛ в биомембранах [26]. Повышение активности GPO в крови мужчин с бесплодием, носителей гетерозиготного полиморфизма GSTP1(AIa114Val), вероятно, носит компенсаторный характер. Активности СОД в эякуляте мужчин с бесплодием, носителей гетерозиготного полиморфизма GSTP1(AIa114Val), недостаточно для инактивации АФК в месте их образования, что свидетельствует об активации процессов липопероксидации.
Заключение. Особенности функционирования системы биотрансформации ксенобиотиков делают уникальным каждого индивида в отношении его адаптационных возможностей – устойчивости или восприимчивости к повреждающим факторам. Глутатиондисульфидная система, безусловно, является важным компонентом антиоксидантной защиты, особенно от эндо- и экзогенных метаболитов, образующихся при окислительном стрессе. Генетически детерминированный дисбаланс в системе глутатионзависимой антиоксидантной защиты определяет активацию ПОЛ и способствует значительному ослаблению метаболической и детоксицирующей функций организма, что приводит к повышению чувствительности клеток к повреждающим воздействиям ксенобиотиков, негативно влияющих на сперматогенез. Ассоциация гетерозиготного полиморфизма GSTP1(Ile105Val) с параметрами окислительного стресса в крови и эякуляте мужчин может служить дополнительным фактором риска развития нарушений репродуктивной функции у мужчин. Глутатион-S-трансфераза является важнейшим полифункциональным белком эякулята, поскольку не только осуществляет защиту от ксенобиотиков и их метаболитов, но и, локализуясь на поверхности сперматозоидов, играет роль триггера, запускающего их взаимодействие с лигандами zona pillucida на этапе инициации акросомальной реакции. В связи с этим определение GST в эякуляте может быть использовано для определения оплодотворяющей способности сперматозоидов у мужчин.
