Factors Affecting Spermatogenesis Preservation in Rats with Seminiferous Tract Obstruction


S.I. Gamidov, R.I. Ovchinnikov, A.Ju. Popova, O.M. Krasova, M.D. Polivoda, E.A. Dubova, K.A. Pavlov

1Department of Urology of RNRMU n.a. N.I. Pirogov; 2Department of Andrology and Urology of V.I. Kulakov Research Center of Obstetrics, Gynecology, and Perinatology; 3 Department of Obstetrics, Gynecology, Perinatology and Reproductology, Institute for Professional Education of Physicians, I.M. Sechenov First MSMU; 4 Department of Experimental Surgery of Research Institute for Fundamental and Applied Biomedical Studies of RNRMU n.a. N.I. Pirogov; 5 2nd Pathology and Autopsy Department of V.I. Kulakov Research Center of Obstetrics, Gynecology, and Perinatology
The aim of the study was to examine the effect of the seminal tract obstruction of different degree and duration on the morphological and functional condition of testicular tissue.
The study was conducted in 50 male Wistar rats. Three experimental models of seminiferous tract obstruction were set up: obstruction of the proximal part of the ductus deferens, obstruction of the distal part of the ductus deferens and obstruction of at the epididymis level. Morphological evaluation of testicular tissue was performed at 3 and 6 months after the obstruction. It was found that obstruction at the epididymis level caused the most severe impairment of spermatogenesis.

Введение. На сегодняшний день вопрос бесплодного брака остается значимой медико-социальной проблемой, что объясняет повышенное внимание исследователей к состоянию репродуктивного здоровья как женщины, так и мужчины [1, 2]. Наиболее сложной для лечения формой мужского бесплодия является обструктивная азооспермия (ОА), определяемая как полное отсутствие сперматозоидов в эякуляте вследствие нарушения проходимости семявыносящих путей [3, 4]. Вспомогательные репродуктивные технологии – основная возможность для пациентов с обструктивной азооспермией иметь собственных генетических детей. Однако применяемые пункционные методики биопсии яичка не всегда эффективны в плане получения пригодных для ИКСИ (от англ. ICSI – IntraCytoplasmic Sperm Injection, интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида) сперматозоидов. В литературе вопрос сохранности сперматогенеза в тканях яичка при обструкции семявыносящих путей излагается весьма противоречиво [5–9].

Цель исследования: изучить влияние уровня и длительности обструкции семявыносящих путей на морфологическое и функциональное состояние ткани яичка.

Материалы и методы. Исследование проведено на 50 крысах-самцах линии Вистар массой 410–640 г с учетом правил использования экспериментальных животных и в соответствии с принципами биоэтики. Животные содержались при 12-часовом световом дне на стандартном рационе.

В эксперименте создано 3 модели обструкции: 1-я группа (n=14) – обструкция проксимальной части семявыносящего протока (СП), 2-я (n=14) – обструкция дистальной части СП, 3-я (n=14) – обструкция на уровне придатка яичка. Четвертая группа (интактные животные; n=8) считалась контрольной. Животных наблюдали в течение 3 и 6 мес с момента формирования обструкции. В соответствии со сроками наблюдения животные 1–3-й групп были разделены на две подгруппы.

Обезболивание достигали путем внутримышечного введения раствора золетил 100 в дозе 2 мг на 1 кг массы тела, рометара 2% 0,15 мл/кг. По вентральной поверхности мошонки производили продольный разрез до 2 см с переходом на паховую область. Животным 1-й группы выделяли семенной канатик до наружного отверстия пахового канала. Животным 2-й группы выделяли яичко, придаток и СП в области выхода из хвоста придатка яичка. Семявыносящий проток перевязывали двумя викриловыми лигатурами, затем пересекали. Животным 3-й группы между яичком и головкой придатка накладывали две викриловые лигатуры и придаток отсекали от яичка. Рану послойно ушивали непрерывным викриловым швом. Интраоперационно измеряли поперечные и продольные размеры яичек. Объем яичек рассчитывали путем умножения трех измерений яичка и коэффициента эллипсоидности (0,479). По окончании сроков наблюдения (3 или 6 мес) удаляли яички, придатки и СП, измеряли линейные размеры яичек. Полученный материал фиксировали в жидкости Боуэна в течение 24 ч.

Гистологические препараты готовили по общепринятой методике, окрашивали гематоксилином и эозином. На полученных препаратах подсчитывали 100 поперечных срезов семенных канальцев (СК). Был произведен подсчет количества СК, содержащих четыре стадии развития половых клеток (сперматогонии, сперматоциты, сперматиды и сперматозоиды), три стадии (сперматогонии, сперматоциты и сперматиды), две стадии (сперматогонии и сперматоциты), одну стадию (сперматогонии) и содержащие только клетки Сертоли. Определяли долю (в %) СК каждого из перечисленных типов, а также индекс сперматогенеза – сумму всех подсчитанных в 100 СК стадий клеток сперматогенеза, поделенную на 100 (в %).

Статистическую обработку данных проводили с помощью программы Statistica for Windows v. 7.0. Все количественные показатели представлены в форме среднее значение±стандартное отклонение. Анализ данных проводили с использованием критерия Вилкоксона.

Результаты и обсуждение. Изменения объема яичка (Vt) оценивали в зависимости от уровня и сроков обструкции (табл. 1). Во всех группах Vt достоверно был ниже исходных параметров (р<0,05). Наиболее выраженные изменения наблюдались при обструкции на уровне придатка яичка – объем был снижен более чем в 2 раза. В 3-й группе Vt достоверно отличался от Vt во 2-й группе (р<0,05). В свою очередь во 2-й группе Vt оказался достоверно меньше, чем в 1-й (р<0,05). Полученные данные демонстрируют, что снижение объема яичка – одного из прогностических факторов сохранности сперматогенеза – зависит от уровня обструкции семявыносящих путей.

Результаты морфологической оценки ткани яичка (табл. 2) сравнивали с контролем и между группами. В группе контроля индекс сперматогенеза составил 3,98±0,01. Практически все СК (98,63±0,96%) содержали сперматозоиды (рис. 1). В остальных исследуемых группах отмечали снижение индекса сперматогенеза, количества СК с четырьмя стадиями развития герминогенных клеток, увеличение количества пустых СК и появление СК одной, двумя и тремя стадиями развития клеток.

Через 3 мес обструкции проксимальной части СП наблюдали умеренное подавление сперматогенеза. Индекс сперматогенеза был достоверно ниже контроля и составил 2,87±0,62 (р<0,05). Герминогенные клетки на всех стадиях созревания отмечались в 51,93±21,87% СК (рис. 2). Отмечено появление канальцев с тремя, двумя и одной стадиями созревания. 15,43±11,34% СК содержали только клетки Сертоли. Спустя 6 мес изменения сперматогенеза были более выражены и по всем оцениваемым параметрам достоверно отличались от таковых спустя 3 мес наблюдения. Так, индекс сперматогенеза снизился до 1,71±1,27, 34,34±28,62%, СК содержали сперматозоиды в резко уменьшенном количестве. Увеличилось количество СК, содержащих только клетки Сертоли (50,57±33,09%). Таким образом, с увеличением сроков обструкции на уровне проксимальной части СП снижался индекс сперматогенеза и увеличивалось количество пустых канальцев, содержащих только клетки Сертоли.

Обструкция дистальной части СП (2-я группа) привела к достоверному снижению всех параметров сперматогенеза по сравнению с контролем. Индекс сперматогенеза составил лишь 0,95±0,23, единичные сперматозоиды обнаруживались в 14,29±3,65% канальцев. Больше половины СК содержали только клетки Сертоли. В отдаленном периоде (6 мес) были получены схожие данные (табл. 2), при этом статистически значимых различий по сравнению с таковыми по итогам 3-месячного наблюдения этой группы выявлено не было (р>0,05). Таким образом, установлено, что обструкция дистальной части СП сопровождается нарушением сперматогенеза и выраженным снижением всех его показателей, однако степень выраженности этих изменений не зависит от срока обструкции.

Наиболее выраженные изменения отмечали при обструкции на уровне придатка яичка (3-я группа). Через 3 мес обструкции индекс сперматогенеза снизился в 4 раза по сравнению с контролем и составил 0,85±0,24. Зрелые сперматозоиды наблюдали лишь в 9,29±2,73% СК. В 69,29±8,56% СК отсутствовали клетки герминогенного эпителия, они содержали только клетки Сертоли с утолщенной базальной мембраной с выраженными дистрофическими изменениями. По прошествии 6 мес эпидидимальная обструкция привела к атрофии семенных канальцев (рис. 3). Степень нарушения сперматогенеза была статистически значимо более выражена по сравнению с предыдущим сроком наблюдения (р<0,05). Индекс сперматогенеза составил 0,08±0,09%. Лишь у двух животных этой группы обнаружили единичные СК с вызреванием герминогенных клеток до трех, двух и одной стадий. Остальные СК практически не имели просвета и содержали только клетки Сертоли. При анализе зависимости индекса сперматогенеза от срока обструкции на уровне придатка яичка отмечалась сильная статистическая взаимосвязь, при этом связь носит «обратный характер» (r=-0,96; р<0,05) (рис. 3). То есть снижение индекса сперматогенеза зависит от длительности обструкции на уровне придатка яичка. Кроме того, отмечается сильная прямая корреляция (r=0,96, р<0,05) количества семенных канальцев (%), содержащих только клетки Сертоли, и сильная обратная корреляция (r=-0,96, р<0,05) количества канальцев с четырьмя стадиями созревания в зависимости от срока обструкции. Таким образом, увеличением срока обструкции на уровне придатка яичка увеличивалось количество пустых семенных канальцев, содержащих только клетки Сертоли, и уменьшалось количество канальцев, содержащих сперматозоиды.

После определения показателей сперматогенеза в группах мы оценили степень выраженности этих изменений в зависимости от уровня обструкции у наблюдаемых в течение 3 мес животных. Наиболее высокий индекс сперматогенеза и наименьшее количество пустых канальцев отмечали при обструкции проксимальной части СП (р<0,05). При этом у животных с более дистальным уровнем обструкции (2-я и 3-я группы) эти показатели существенно не различались. В то же время количество канальцев, содержащих сперматозоиды, было статистически значимо меньше в 3-й группе, чем во 2-й, а во 2-й группе меньше, чем в 1-й (р<0,05). Индекс сперматогенеза, количество пустых канальцев и канальцев, содержащих сперматозоиды, в группе с эпидидимальной обструкцией достоверно отличались от данных показателей других групп. Эти изменения также оказались более выраженными во 2-й, чем в 1-й, группе. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о прогрессировании нарушений сперматогенеза в связи со сроками обструкции.

Заключение. Данные экспериментального исследования свидетельствуют о существенном влиянии уровня и длительности обструкции семявыносящих путей на морфологическое состояние ткани яичка и сперматогенез. Это выражается в снижении одного из важнейших показателей фертильности – индекса сперматогенеза, уменьшении количества СК, содержащих сперматозоиды, и увеличении числа канальцев, содержащих только клетки Сертоли. Значимое снижение клеточного компонента СК обусловливает регресс объема яичек – одного из прогностических факторов сохранности сперматогенеза. Следует подчеркнуть, что нарушение проходимости на уровне придатка яичка обусловливает наиболее тяжелое нарушение сперматогенеза. В отдаленные сроки наблюдения отмечается полная атрофия семенных канальцев. В то же время для более проксимальных уровней обструкции характерны менее выраженные изменения сперматогенеза. Таким образом, результаты экспериментальной работы объясняют неудачи пункционной аспирации сперматозоидов из яичка у пациентов с ОА. При выборе методики биопсии у пациентов с ОА следует учитывать длительность и уровень обструкции. На наш взгляд, при наличии длительной обструкции на уровне придатка яичка целесообразно выполнение «открытой» микрохирургической методики.


Literature


1. Курило Л.Ф. Оценка сперматогенеза по незрелым половым клеткам. Проблемы репродукции. 1995;3:33–38.

2. Хадсон Б., Пепперелл Р.Д., Вуд К. Бесплодный брак. М.: Медицина, 1986. 331 с.

3. Коган М.И., Сизякин Д.В., Сакунов С.В., Фомкин Р.Г., Пипченко О.И. Структура причинных факторов азооспермии. Тезисы конференции «Мужское здоровье». М., 2003. С. 45–46.

4. American Urological Association Education and Research, Inc. The management of obstructive azoospermia: AUA best practice statement. Linthicum (MD): American Urological Association Education and Research, Inc., 2010. 22 p.

5. Аляев Ю.Г., Амосов А.В., Алленов С.Н., Шестиперов П.А. Получение сперматозоидов методом пункционной биопсии придатка яичка у больных обструктивной азооспермией. Андрология и генитальная хирургия. 2009;2:97.

6. Михайличенко В.В., Новиков А.И., Фесенко В.Н., Казимзаде Э.Д. Особенности диагностики и лечения азооспермии при бесплодии у мужчин. Андрология и генитальная хирургия. 2010:4:32–35.

7. McLachlan R.I., Rajpert-De Meyts E., Hoei-Hansen C.E., de Kretser D.M., Skakkebaek N.E. Histological evaluation of the human testis - approaches to optimizing the clinical value of the assessment: Mini Review. Hum. Reprod. 2007;22(1):2–16.

8. Sarrat R., Whyte J., Torres A., Lostalé F., Díaz M.P. Experimental vasectomy and testicular structure. Histol. Histopathol. 1996;11(1):1–6.

9. Whyte J., Sarrat R., Cisneros A.I., Whyte A., Mazo R., Torres A., Lázaro J. The vasectomized testis. Int. Surg. 2000;85(2):167–174.


About the Autors


Corresponding author: O.M. Krasova; e-mail: silver-shaded@yandex.ru


Бионика Медиа