Введение. В урологической практике нередки ситуации, когда необратимо повреждается один из участков мочевых путей и возникает необходимость замещения поврежденного сегмента другим материалом. Эта ситуация возникает у больных с заболеваниями мочевого пузыря при его злокачественном поражении или при доброкачественных заболеваниях, в лечении которых используется обширная резекция мочевого пузыря (интерстициальный цистит, нейрогенный мочевой пузырь, рефрактерный гиперактивный мочевой пузырь и др.). Для замещения всего органа или его части обычно используются сегменты тонкой, толстой или прямой кишки, илеоцекального угла, большой кривизны желудка на сосудистой ножке [1–6].

Однако помимо высокой травматичности кишечной пластики мочевого пузыря, а также высокого риска развития хирургических осложнений имеется существенная проблема развития мочевой инфекции, камней мочевого резервуара, рака в пересаженном отделе кишки, а также метаболических нарушений, связанных с различной функцией слизистой оболочки пересаженного сегмента кишки или желудка и слизистой оболочки мочевых путей [7–10].

В связи с этим изучается вопрос об альтернативных вариантах заместительной пластики мочевых путей с использованием как специально обработанных аллогенных и ксеногенных тканей, так и искусственно созданных заменителей стенки органа. Одним из перспективных материалов является коллаген, выделенный из тканей животных, к достоинствам которого относятся отсутствие токсических и канцерогенных свойств, слабая антигенность, устойчивость к тканевым ферментам, регулируемая скорость лизиса в организме, способность образовывать комплексы с биологически активными веществами, стимуляция собственных тканей организма [11–12]. Особенностью белков данного класса является их филогенетическое родство у разных видов животных и человека, что позволяет использовать ксеногенный коллаген для разработки биоматриц [13]. Коллаген считается одним из наиболее перспективных материалов временного направляющего каркаса для регенерации за счет постепенного замещения прилежащими собственными тканями организма, что выгодно отличает его от синтетических полимерных материалов, используемых в реконструктивной хирургии [14].

Проведенное нами ранее экспериментальное исследование показало, что заместительная пластика мочевого пузыря после его резекции мембраной из свиного коллагена I типа приводит к хорошим результатам, обеспечивая герметичность реконструированного органа и постепенное замещение коллагенового имплантата собственными тканями организма [15]. Однако полученные нами результаты и данные литературы свидетельствуют, что наряду с хорошей приживляемостью коллагеновые мембраны не обеспечивали ожидаемого увеличения объема мочевого пузыря и уменьшения его ригидности, что было связано с замещением коллагенового каркаса преимущественно соединительной тканью при слабой регенерации мышечной ткани [11, 16–18].

В связи с этим актуален вопрос о стимуляции васкуляризации и врастания клеток из окружающих тканей в имплантированный коллагеновый каркас для формирования полноценной стенки мочевого пузыря. С этой целью используют его покрытие стволовыми клетками различного происхождения (аутологичными или аллогенными мезенхимальными клетками костного мозга, жировой ткани, пуповинной крови, амниотической жидкости и др.) [19–24]. Поскольку стимуляция регенерации при терапии стволовыми и прогениторными клетками осуществляется преимущественно за счет секреции ими комплекса сигнальных молекул [25–27], ряд авторов предлагают включать в состав мембран компоненты этого комплекса (факторы роста тромбоцитов ВВ и СС, основной фактор роста фибробластов, фактор роста эндотелия сосудов, фактор роста эпидермиса, инсулиноподобный фактор роста-1, трансформирующий фактор роста β), также получая положительные функциональные результаты [28–34].

По нашему мнению, использование сбалансированного комплекса секреторных компонентов, продуцируемых стволовыми и прогениторными клетками и стимулирующих регенерацию органа, может оказать более выраженный эффект, чем использование отдельных его компонентов.

Целью настоящего исследования было изучить эффективность заместительной пластики мочевого пузыря мембраной из коллагена I типа, содержащей концентрированную кондиционированную среду (КС) мезенхимных стволовых/стромальных клеток, выделенных из жировой ткани человека (МСК ЖТ), по сравнению с использованием стандартной коллагеновой мембраны, не содержащей этого компонента.

Материалы и методы. Экспериментальные исследования проведены в хронических опытах на 14 новозеландских кроликах-самцах массой 3–3,5 кг. Животных содержали в стандартных условиях вивария на рационе из специального комбикорма с неограниченным доступом к воде. Все эксперименты проводили с соблюдением принципов Европейской конвенции о гуманном отношении к животным. Опыты обязательно проводились в условиях общего обезболивания. Эвтаназия животных произведена избыточным введением наркотического вещества (тиопентала натрия).

Методика операций. Всем животным выполнена резекция мочевого пузыря с удалением части стенки размером 2х2 см, что уменьшило его емкость примерно на 40%. У 5 кроликов дефект замещали стандартной мембраной, изготовленной из свиного коллагена I типа (коллагеновая мембрана «Matritek» производства ООО фирмы «Имтек») (1-я серия), у 5 кроликов – мембраной того же состава, включающей КС МСК ЖТ (2-я серия). Четырем животным (3-я серия) произвели ушивание образовавшегося дефекта.

Все операции проведены в условиях общего наркоза с использованием смеси препаратов золетил 100 («Virbac S.A.») и XylaVET professional (Pharmamagist Kft) в соотношении 2:1 с доведением концентрации золетила до 30 мг/мл физиологическим раствором. Полученный раствор введен в концентрации 1 мл/кг внутримышечно. Для профилактики инфекционных осложнений внутримышечно введен антибиотик (гентамицин 40 мг внутримышечно или амоксиклав 200 мг внутривенно однократно).

После введения в наркоз катетеризировали мочевой пузырь по уретре для выведения мочи и определения исходной функциональной емкости мочевого пузыря. Производили нижнесрединную лапаротомию и выводили в рану мочевой пузырь.

В бессосудистой зоне иссекали участок стенки органа размером примерно 2х2 см. Дефект стенки или ушивали или замещали коллагеновой мембраной с ее анастомозированием со стенкой мочевого пузыря непрерывным обвивным швом атравматической нитью «Vicryl» 4/0. Затем мочевой пузырь погружали в брюшную полость и ушивали лапаротомную рану, используя непрерывный обвивной шов для ушивания мышечной стенки и отдельные узловые швы на кожу атравматической нитью Vicryl 2/0.

Методика изготовления коллагеновых мембран, содержащих или не содержащих КС МСК ЖТ. Стерильный прозрачный нейтральный раствор коллагена I типа, выделенного из тканей животных («ВИСКОЛЛ», кат. Р С11-ND, производство ООО фирмы «ИМТЕК», Россия), в объеме 1 мл помещали в стерильную культуральную чашку с площадью поверхности 2 см2. Затем чашку перемещали в CO2-инкубатор и инкубировали при 37°С до тех пор, пока не формировался гидрогель, который в дальнейшем подвергали сушке в асептических условиях при температуре 20–25°С в течение 7 дней. Процесс сушки считался полностью завершенным, когда гидрогель переходил в форму жесткого стеклоподобного материала. Полученные таким образом мембраны расфасовывали в индивидуальную стерильную упаковку с соответствующей маркировкой (рис. 1).

Для изготовления коллагеновых мембран, содержащих КС МСК ЖТ, предварительно культивировали МСК, выделенные из подкожной жировой ткани здоровых доноров обоих полов, полученной при проведении малого хирургического вмешательства под местной анестезией или в ходе плановых хирургических операций. Для выделения клеток биоматериал в стерильных условиях ламинарного бокса измельчали сосудистыми ножницами до консистенции суспензии мелких (размером не более 2 мм3) кусочков и смешивали с растворами ферментов коллагеназы I типа (200 ЕД/мл, «Worthington Biochemical», США) и диспазы (40 ЕД/мл, «Sigma», Германия) при соотношении объема ткани (в мл) к объему ферментативного раствора (в мл) 1:2. Образец инкубировали при 37°C в течение 30–45 мин при постоянном встряхивании. По окончании инкубации добавляли равный объем среды роста МСК и центрифугировали при 200 g в течение 8 мин. Белесый поверхностный слой, состоявший из зрелых адипоцитов и кусочков ферментативно необработанной ткани, удаляли с помощью вакуумного насоса, а осадок, состоявший из клеток стромы жировой ткани, клеток сосудистой стенки и крови, суспендировали в стерильной деионизованной воде для лизирования эритроцитов. Чтобы восстановить осмотическое давление, добавляли соответствующий объем 10-кратного фосфатного буфера, а затем фильтровали через нейлоновые фильтры размером пор 100 мкм («BD Falcon Cell Strainer», США) и центрифугировали при 200 g 5 мин. Супернатант удаляли, а осадок ресуспендировали в среде, поддерживающей рост недифференцированных мезенхимных прогениторных клеток человека (Advance Stem Cell Basal Medium, далее – AdvanceSM, «HyClone», США), содержащей 10% смеси факторов роста (Advance Stem Cell Growth Supplement, «HyClone») и 100 ЕД/мл пенициллина/стрептомицина («HyClone»). Выделенные клетки высаживали на чашки Петри («Corning», США) в концентрации 5x104/см3 и инкубировали в СО2-инкубаторе (5% СО2; 95% воздуха) при 37°С. На следующий день в чашках меняли среду для удаления неприкрепившихся клеток. Смену среды проводили каждые 2–3 дня; при достижении 70–80% конфлюента клетки рассаживали в соотношении 1:3 с использованием раствора QTase («HyClone»). Жизнеспособность клеток оценивали путем окраски клеток раствором трипанового синего и подсчета количества живых и мертвых клеток с помощью счетчика клеток (Cell Counter, «Invitrogen», США).

Для получения кондиционированной среды МСК ЖТ 4–5 пассажа, достигших 80% конфлюента, промывали трехкратно раствором Хэнкса («ПанЭко», Россия). К чашкам добавляли среду DMEM-LG. Клетки культивировали в течение 7 дней, после чего кондиционированную среду собирали, очищали от клеточного дебриса путем центрифугирования в течение 10 мин при 300 g, затем концентрировали в 50 раз с помощью ультрафильтрации через мембраны из регенерированной целлюлозы с указанным отсечением 10 кДа в центрифужных картриджах («Millipore», США).

Полученную концентрированную КС смешивали с 2,5%-ным свиным стерильным нейтральным коллагеновым гелем («ВИСКОЛЛ», кат. Р С11-ND, производство ООО фирмы «ИМТЕК», Россия) в соотношении по объему 1:4. Затем инкубировали смесь при 4°С в течение 2 ч. Полученный раствор равномерно распределяли на дне лунки 24-луночного планшета с площадью поверхности около 2 см2, помещали планшет в CO2-инкубатор и инкубировали при 37°C в течение 30 мин, пока не сформируется гидрогель. Приготовленный гидрогель в планшете высушивали в асептических условиях при температуре 37°C до полного высыхания. Процесс сушки считали полностью завершенным, когда гидрогель переходил в форму жесткого стеклоподобного материала.

Методы оценки результатов исследования. Оценку результатов исследования проводили через 1 мес после операции. Сравниваемые показатели: оценка степени интеграции коллагенового имплантата в окружающие ткани мочевого пузыря, степень регенерации слизистой оболочки и гладкомышечных клеток в новообразованной стенке, полноценность восстановления в ней кровообращения и состояние резервуарной функции реконструированного мочевого пузыря. Для функциональных исследований производили пункцию мочевого пузыря в области его верхушки внутривенным катетером G20, подсоединенным к инфузионной системе и датчику давления. Функциональное исследование выполняли как на опорожненном мочевом пузыре, так и в процессе проведения цистометрии наполнения, что позволило определить его комплаентность путем определения динамики возрастания внутрипузырного давления при разной степени наполнения мочевого пузыря и его максимальную цистометрическую емкость.

В конце эксперимента удаляли мочевой пузырь, визуально оценивали степень эпителизации внутренней поверхности имплантированной мембраны и брали образцы ткани для гистологического и морфометрического исследования.

Полученные цифровые данные подвергали статистической обработке с помощью компьютерных программ Excel 2007 и Statistica 8.0. Усредненные значения в исследуемых группах выражали в виде средней арифметической±ошибка средней (М±m). Достоверность различий между группами определяли с использованием t-критерия Стьюдента и критерия Вилкоксона–Манна. Различия признавали статистически значимыми при p<0,05.

Результаты. В экспериментах с имплантацией стандартной коллагеновой мембраны при ревизии области операции через 1 мес в обеих сериях выявляли полную интеграцию вшитой мембраны в стенку мочевого пузыря (рис. 2). Область вшитой мембраны прикрыта новообразованными тканями.

При вскрытии мочевого пузыря установлено, что внутренняя поверхность имплантированной стандартной мембраны почти на всем протяжении покрыта слизистой оболочкой с небольшими участками оставшегося нерассосавшегося коллагена. Слизистая оболочка новообразованной стенки выглядела слегка цианотичной (рис. 3, а). В опытах с имплантацией коллагеновой мембраны с КС МСК ЖТ также выявлена полная эпителизация внутренней поверхности. Новообразованная слизистая оболочка выглядела нормальной, сохраняла типичную складчатость (рис. 3, б).

При гистологическом исследовании в препаратах с имплантацией стандартной коллагеновой мембраны констатировали субтотальное ее замещение соединительной тканью с врастанием отдельных кровеносных сосудов (рис. 4, а). Люминальная поверхность почти полностью эпителизирована, но эпителий выглядел атрофичным, а в отдельных участках отсутствовал. В ткани, заместившей коллагеновую мембрану, выявлены лишь единичные гладкомышечные клетки, т.е. на месте мембраны сформировался преимущественно соединительнотканный каркас (рис. 4, б).

Гистологическое исследование препаратов при имплантации мембраны с КС МСК ЖТ выявило ее почти полное замещение тканью мочевого пузыря. Люминальная поверхность имплантата была выстлана слизистой оболочкой, состоявшей из полноценной уротелиальной выстилки (многорядным эпителием) и подслизистого слоя, содержавшего полнокровные кровеносные сосуды (рис. 5, а). Новообразованная стенка мочевого пузыря содержала комплексы гладкомышечных клеток в значительном количестве, между которыми имелись тонкие прослойки соединительной ткани (рис. 5, б). Гладкомышечные клетки активно врастали в оставшийся коллаген. В новообразованной стенке имел место активный ангиогенез (рис. 5, в).

Для более точной характеристики активности регенерационных процессов мы провели количественную оценку морфометрических параметров, характеризующих их интенсивность, сравнив изучаемые показатели в группах с цистопластикой с данными серии с ушиванием мочевого пузыря (см. таблицу). Результаты этого анализа показали, что по сравнению с опытами с ушиванием дефекта стенки мочевого пузыря без цистопластики использование стандартной коллагеновой мембраны характеризовалось большей протяженностью деэпителизированных участков базальной мембраны новообразованной слизистой, сохранением значительных участков нерезорбированного коллагена, меньшей плотностью новообразованных сосудов, а также значительно менее выраженной регенерацией гладкомышечных клеток в зоне операции. В то же время в опытах с замещением резецированной стенки мембраной с КС МСК ЖТ отмечены почти полная резорбция имплантированной мембраны, наименьшие значения деэпителизированной внутренней поверхности стенки, наиболее выраженный ангиогенез и активная регенерация гладкомышечных клеток, по интенсивности значительно превышающая этот показатель в других сериях.

Таким образом, при использовании мембран с КС МСК ЖТ происходит более быстрая и более полноценная регенерация новообразованной стенки мочевого пузыря, замещающей постепенно резорбирующийся имплантат по сравнению со стандартной коллагеновой мембраной.

Важным моментом в нашем исследовании было определить: улучшает ли методика заместительной цистопластики коллагеновыми мембранами функциональное состояние резецированного мочевого пузыря наряду с ускорением регенерации его стенки, а если улучшает, то в какой степени? При исследовании функции реконструированного мочевого пузыря мы оценивали параметры, характеризующие функцию накопления. При изучении максимальной функциональной емкости мочевого пузыря сразу после резекции и через 1 мес выявлено, что в серии опытов с резекцией мочевого пузыря без цистопластики сразу после резекции его максимальная емкость уменьшилась с 38±1 до 23±1 мл (p<0,001). Через 1 мес после резекции она существенно не изменилась, составив 25±1 мл. В опытах с замещением дефекта стенки мочевого пузыря после его резекции стандартной коллагеновой мембраной через 1 мес после операции максимальная емкость мочевого пузыря составила 26±1 мл, а при использовании коллагеновой мембраны, содержащей КС МСК ЖТ, она статистически значимо (p<0,01) возросла до 35±2 мл, приблизившись к нормальным значениям (рис. 6).

Другой важный показатель функционального состояния мочевого пузыря – способность его стенки сохранять низкий тонус при постепенном наполнении мочой без резкого роста внутрипузырного давления (показатель «объем/давление», характеризующий комплаентность мочевого пузыря). Проведенное исследование показало, что в серии опытов, где дефект мочевого пузыря замещали коллагеновой мембраной с КС МСК ЖТ, комплаентность реконструированного мочевого пузыря не отличалась от нормы, которая определялась путем проведения цистометрии наполнения на интактном мочевом пузыре до проведения на нем хирургических манипуляций. В серии опытов, где использовали коллагеновую мембрану без кондиционированной среды, а также при резекции без цистопластики отмечали резкое повышение внутрипузырного давления даже при небольшом объеме введенной жидкости (рис. 7). То есть в этих опытах комплаентность реконструированного мочевого пузыря оказалась значительно сниженной, что может быть связано с тем, что часть стенки органа замещалась функционально неактивной соединительной тканью, обладающей относительно высокой жесткостью, тогда как при использовании для цистопластики мембраны со средой культивирования стволовых клеток в новообразованной стенке регенерировали функционально активные гладкомышечные клетки (рис. 4, 5). Наихудшие результаты, полученные в опытах с резекцией мочевого пузыря без цистопластики, могут быть связаны с уменьшением его функциональной емкости (рис. 6) и рубцеванием стенки в зоне ушивания дефекта.

Обсуждение. Таким образом, результаты проведенного исследования убедительно показали, что включение в состав коллагеновой мембраны кондиционированной среды, содержащей продукты секреции МСК ЖТ человека, существенно повышает ее способность полноценно замещать стенку мочевого пузыря. Хотя использование стандартной мембраны из коллагена I типа также позволяет заместить часть стенки органа с сохранением его герметичности, новообразованная стенка оказывается малофункциональной, так как состоит преимущественно из соединительной ткани, заместившей коллагеновую основу, в результате чего происходит неполное восстановление функциональной емкости мочевого пузыря и его комплаентности. Включение в состав мембраны КС МСК ЖТ за счет стимуляции неоангиогенеза, врастания и регенерации гладкомышечных клеток и более полноценной эпителизации внутренней поверхности обеспечивает практически полное восстановление показателей, характеризующих накопительную функцию реконструированного мочевого пузыря.

Рядом авторов показано, что именно паракринная активность стволовых клеток (секреция комплекса факторов роста, цитокинов, противовоспалительных пептидов и других факторов) служит основным механизмом стимуляции регенерации поврежденных органов за счет активации резидентных стволовых клеток и стимуляции регенерации дифференцированных функционально активных клеток [25–27]. Включение этих факторов в состав биоинженерных конструкций, используемых для замещения мочевых путей, значительно повышало их функциональные свойства [32, 35, 36]. При этом отмечалось, что использование комплекса сигнальных молекул оказывает более выраженный стимулирующий эффект, чем каждая из них по отдельности [31, 37, 38]. Данные литературы свидетельствуют, что эффект иммобилизированных на коллагеновом матриксе молекул, секретируемых стволовыми и прогениторными клетками, сопоставим со стимулирующим действием самих клеток. Также доказано, что стимуляция регенерации клеточных структур при заместительной пластике мочевого пузыря происходит за счет постепенного высвобождения биологически активных факторов из коллагеновой основы [30, 39, 40].

Полученные нами результаты подтверждают перспективность такого подхода. Включение в состав коллагеновой мембраны полного комплекса продуктов, секретируемых стволовыми и прогениторными клетками, в среду их культивирования значительно повышало функциональную полноценность новообразованной стенки мочевого пузыря, сформировавшейся на месте имплантированной мембраны. Использование иммобилизированных на коллагеновой основе сигнальных молекул в перспективе может быть решением ряда проблем, связанных с использованием стволовых клеток, в частности дефицита клеточного материала, иммунологических, юридических и др.

Работа выполнена на базе Медицинского научно-образовательного центра МГУ им. М. В. Ломоносова и факультета фундаментальной медицины МГУ им. М. В. Ломоносова при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ (Соглашение о субсидии № 14.607.21.0045 от 22.08.2014, уникальный идентификатор прикладных научных исследований (проекта) RFMEFI60714X0045).