Стандартным этапом лапароскопической резекции почки является интраоперационная окклюзия почечной артерии, выполняемая с целью обеспечения бескровности операционного поля, минимизации потерь крови, оптимального визуального контроля в процессе иссечения пораженного фрагмента ренальной паренхимы [1, 2]. Временное закрытие просвета a. renalis достигается путем наложения на нее микрососудистого зажима, что приводит к тепловой ишемии органа. Таким образом, пережатие почечной артерии, с одной стороны, служит фактором, необходимым для успеха хирургического вмешательства, с другой – становится потенциальным повреждающим механизмом, способным вызывать или усугублять функциональную недостаточность нефрона [3–5].

Масштабы ишемической альтерации зависят от продолжительности обескровливания. Если длительность окклюзии не превышает 10 мин, структура и функции почечной ткани практически не страдают. При увеличении времени до получаса возникают обратимые изменения молекулярно-клеточных составляющих ренальной паренхимы. В случаях с ишемией в течение 30–60 мин появляется и может быть реализована вероятность развития необратимых нарушений. При остановке кровоснабжения более чем на 60 мин альтерация необратима всегда [6].

Первичным специфическим фактором, повреждающим клеточные сообщества ткани почек при интраоперационной окклюзии a. renalis, является кислородное голодание. Наиболее высокую степень чувствительности к дефициту кислорода проявляют эпителиоциты проксимальных канальцев нефрона [7, 8].

Кислородная депривация приводит к обратимым или необратимым (летальным) структурно-функциональным нарушениям почечных клеток, возникающим во время теплового обескровливания, после него, а также на фоне реперфузии [9–11].

Митохондриальная дисфункция нефроцитов как следствие гипоксии и реоксигенации ренальной паренхимы

Необратимая альтерация нефроцитов лежит в основе их количественного дефицита и уменьшения суммарного функционального потенциала ренальной ткани [12].

Наиболее важными целлюлярными компартментами, при повреждении которых особенно высока вероятность гибели клетки, являются мембраны [12, 13], митохондрии и лизосомы.

При внезапной ишемически-гипоксической катастрофе резко сокращается объем продукции аденозинтрифосфата в митохондриях, вследствие чего останавливается работа ионных насосов и нарушается электролитный состав внутриклеточной среды. При измерениях in vitro АТФ-синтетической функции митохондрий был установлен факт самой высокой чувствительности к кислородному голоданию эпителиоцитов проксимальных канальцев по сравнению с таковой у других в экспериментах как in vivo, так и in vitro [14, 15]. В пределах проксимального фрагмента канальцев максимальная уязвимость к кислородной депривации отмечена для сегмента S-3, при этом обладающего наибольшей гликолитической активностью.

Угнетение образования макроэргов в хондриосомах нефроцитов происходит не только вследствие дефицита кислорода, но и в результате нарушений митохондриальной структуры. Сначала наблюдается обратимая конденсация митохондриального матрикса, расширение пространства между кристами и умеренное их набухание. Более продолжительное обескровливание приводит к еще большему отеку и фрагментации крист, образованию внутри матрикса хлопьевидных уплотнений, содержащих протеины и липиды. После реперфузии образуются уже гранулярные уплотнения из фосфата кальция. Условием восстановления функциональной состоятельности митохондрий является сохранность целостности ее мембраны.

Экспериментальное изучение путей коррекции ишемически-реперфузионного гипоэргоза почечной ткани

Для того чтобы почечная ткань с минимальными потерями пережила период кислородной депривации, осуществляется переход на анаэробный гликолиз.

Успешная нормализация процесса образования АТФ после устранения дефицита кислорода в ткани связана со стабильностью митохондриальных оболочек, а не с низким количеством АТФ во время ишемии. Сам по себе гипоэргоз является, с одной стороны, следствием повреждения мембраны, с другой – повреждающим фактором n-го порядка, активирующим очередные патогенетические цепочки [16].

Для митохондриальной дисфункции характерно разобщение окислительного фосфорилирования, в условиях которого АДФ не фосфорилируется в АТФ. Напротив, под влиянием фермента миокиназы происходит дефосфорилирование всего имеющегося запаса АДФ до АМФ, который сначала аккумулируется, затем под действием дезаминазы конвертируется в инозинмонофосфат (ИМФ) или трансформируется 5-нуклеотидазой в аденозин.

Фермент 5-нуклеотидаза существует в мембранной и цитозольной формах. Ренальная мембранная 5-нуклеотидаза локализуется в оболочках пальцевидных выростов щеточной каймы tt. proximales и в интерстициальных фибробластах. Блокада активности фермента происходит под влиянием АТФ, АДФ, их нуклеотидного аналога α-β-метиленаденозин-5-дифосфата (АМРСР), теофилина. Кроме того, на функциональность 5-дезаминазы оказывает влияние рН среды. В опытах на крысах было установлено, что ингибирование данного энзима происходит при рН, равном 7,6–6,4 (аналогичное значение показателя характерно для ишемизированных участков ткани). Однако при снижении водородного показателя ожидаемого повышения активности 5-нуклеотидазы не отмечено, напротив, гипоактивность изучаемого фермента усиливалась.

В почечной ткани присутствует также АМФ-дезаминаза, но ее активность весьма низкая, что экспериментально доказано незначительным уровнем ИМФ в условиях ишемии [17].

Аденозин и ИМФ используются для образования АТФ. При их расщеплении образуется инозин, который под влиянием фосфорибозилтрансферазы преобразуется в гипоксантингуанин, затем в гипоксантин. Последний может быть снова включен в пул пуринов только до его расщепления на ксантин и мочевую кислоту [17].

Приведенная схема метаболизма аденозина и ИМФ – общая. У разных видов живых организмов существуют свои особенности реализации этой стандартной программы. Например, у кроликов при остром обескровливании почки распад пуринов в изолированных проксимальных канальцах не идет далее гипоксантина вследствие низкой активности ксантиноксидазы [18, 19].

Таким образом, особенности обмена пуринов являются важным фактором повреждения и восстановления при ишемии почки, а индексация метаболитов пуринового цикла – доступным и надежным методом мониторинга данных процессов [12].

В условиях постишемической реперфузии восполнение внутриклеточных АТФ-ресурсов происходит из АМФ. Использование в качестве субстратов нуклеозидов и оснований вследствие сложности и энергоемкости синтеза [31] и феномена вымывания этих соединений из клеток при реперфузии [32] не выгодно. Несмотря на это, многие исследователи указывают на позитивные результаты применения нуклеозидов при острой ишемии почки [17]. Поэтому существует объективная необходимость дальнейшего изучения, во-первых, судьбы клеточного пуринового пула в условиях гипоксии; во-вторых, возможностей применения экзогенных пуринов для оптимизации восстановления ресурсов АТФ при реперфузии; в-третьих, лимитирования процессов деградации пуринов в условиях ишемии [20].

Такие эксперименты проводились, и на основании полученных результатов было сделано несколько заключений. Прежде всего, подтвердилось предположение о том, что биосинтез АТФ в проксимальных канальцах интенсифицируется при использовании экзогенных нуклеозидов и/или аденозина [19, 21]. Меньшая эффективность аденозина объясняется тем, что это соединение в высоких целлюлярных количествах по механизму обратной связи блокирует активность аденозинкиназы и останавливает образование АМФ. Введенные извне нуклеозиды расщепляются до аденозина, следовательно, максимальные концентрации аденозина формируются не сразу, а в течение определенного времени. Короткие эпизоды реперфузии в условиях ишемии с учетом эффекта вымывания нуклеотидов не улучшают восстановления пула.

Существует еще одно направление качественной и количественной экспериментальной коррекции гипоэргоза – инактивация ферментов, отвечающих за катаболизм АМФ: АМФ-дезаминаза, переводящей реакции АМФ в ИМФ и 5-нуклеотидазы, катализирующей расщепление АМФ до аденозина. В качестве ингибиторов АМФ-дезаминазы применяют 2-дезоксикоформицин, 5-нуклеотидазы – АМРСР [21, 22]. В результате уровень целлюлярной АТФ нормализуется в течение первых 2 ч после реперфузии; почечные функциональные параметры – через 24 ч после ишемии.

Интрацеллюлярный ацидоз

Одним из неспецифических проявлений повреждения клетки, в том числе и ишемического, является ацидоз, связанный с распадом органических кислот под влиянием лизосомальных гидролитических ферментов. По мнению ряда исследователей, закисление внутриклеточной среды в таких ситуациях может иметь защитное значение, что подтверждено на моделях аноксии кардиомиоцитов, асцитных клеток Эрлиха, изолированных гепатоцитов.

Экспериментально установлен критический уровень рН, равный 6,9–7,0, при котором устойчивость в проксимальных канальцах к гипоксии максимальна [23]. Предположительно в условиях сниженного рН возрастание устойчивости к гипоксии связано с инактивацией Na-H-АТФазы и торможением энергоемкого Na/H обмена [24].

В экспериментах установлено, что при снижении рН с 7,5 до 6,5, во-первых, уменьшается трансмембранное поступление Са++ в гиалоплазму; во-вторых, блокируются аффинность кальмодулина к Са++ и Са-кальмодуллинопосредованные процессы; в-третьих, резко ингибируется активность мембранных фосфолипаз (оптимум рН>7,0) [25], т.е. в сущности происходят мембранстабилизирующие процессы.

Гипоксически-опосредованное набухание ренальных клеток

Изменения формы и объема клеток в условиях дефицита кислорода происходят в результате интрацеллюлярного повышения коллоидно-осмотического давления и движения молекул воды внутрь клетки, чему способствует ограничение активности К-Na-АТФазы в условиях гипоксии.

В ткани почек набухание и отек эндотелиоцитов микрососудов и эпителиоцитов канальцев уменьшают диаметр просвета приносящих микрососудов, что приводит к агрегации и агглютинации форменных элементов [26], дальнейшим нарушениям транскапиллярного обмена, усугублению гипоксии и дистрофии [27].

После реперфузии и реоксигенации набухание клеток быстро регрессирует [27–29].

В ренальной паренхиме протекция непроникающими растворами увеличивает эффективность реперфузии и реоксигенации почечной ткани за счет сохранения и коррекции объема и структуры клеток и клеточных компартментов, снятие внутриканальцевой обструкции усилением диуреза, снятие околоканальцевой сосудистой обструкции [30], стабилизации мембран и ограничение свободно-радикального повреждения.

Нарушения внутриклеточного баланса кальция

При целлюлярной альтерации развивается феномен «кальциевой перегрузки», играющий важную роль в прогрессировании процесса и усугублении возникших расстройств. Количество данного 2-валентного катиона в цитоплазме неповрежденной клетки составляет 100 нМоль (1/10000 внеклеточного уровня) и регулируется Са-АТФазой и Na-Са-АТФазой эндоплазматического ретикулума и плазматической мембраны. В митохондриях концентрация кальция очень низкая, но она возрастает при увеличении таковой в цитоплазме более 400–500 нмоль. Микросомы здоровой клетки содержат количество катиона, достаточное для подъема уровня цитозольного Са++ до 1 мкмоль [31].

При летальном ишемическом и реперфузионном повреждениях клеток формируется кальциевая перегрузка – идет накопление Са++ сначала в митохондриях (в основном) [32] и эндоплазматическом ретикулуме за счет реоксигенационных нарушений Na/Ca-обмена (энергозависимый обмен внутриклеточного Na+ на внеклеточный Са), затем – в цитоплазме, так как в условиях гипо-, аноксического гипоэргоза масштабы аккумулирования катиона в митохондриях уменьшаются [32].

Свободнорадикальный механизм повреждения почечной ткани

Основными фигурантами свободнорадикального механизма повреждения являются активные формы кислорода (АФК) – супероксид-анион-радикал О2-, перекись водорода (Н2О2) и гидроксил-радикал ОН-. Именно радикал ОН- реагирует с жирными кислотами липидного бислоя, в котором запускает процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) с попеременным образованием липидных радикалов и радикалов липоперекисей [33], что приводит к изменению физико-химических свойств мембраны и появлению высокой вероятности формирования на ней потенциала пробоя, самопроизвольного возрастания силы тока и в конечном итоге – электрического пробоя биологических мембран (как общеклеточных, так и мембран органелл). Воздействие активных форм кислорода также влечет за собой деструктуризацию белковых молекул и нуклеиновых кислот, инактивацию ферментных систем [34–36].

Эндогенные системы антиоксидантной защиты представлены ферментами СОД и глютатионредуктазой, которые нейтрализуют супероксидный анион-радикал и перекись водорода, предотвращают образование гидроксильного радикала. Аналогичное действие оказывает аллопуринол. Маннитол проявляет свойства «перехватчика» свободных радикалов [35]. Дефероксамин снижает уровень 2-валентного железа в плазме и ограничивает образование ОН- [37].

Полученные результаты многочисленных экспериментальных исследований свидетельствуют, во-первых, о том, что главным повреждающим фактором при остром обескровливании и последующей реперфузии почки является ишемическая гипоксия ренальной ткани, а реперфузионные структурно-функциональные нарушения выражаются в значительно меньшей степени. Более того, в подавляющем большинстве опытов in vitro изучались реакции на гипоксическое повреждение S-1- и S-2-сегментов проксимальных канальцев, расположенных в корковом слое почки, тогда как структурно-функциональные характеристики сегмента S-3, наиболее предрасположенного к повреждающему действию дефицита кислорода, остаются неисследованными в достаточной степени. С учетом отмеченной выше недостаточной информативной состоятельности результатов проблема биологической значимости свободно-радикального повреждения почечной ткани в условиях ишемии и последующей реперфузии остается актуальной в настоящее время и нуждается в продолжении научного поиска.

Вторичная лизосомальная альтерация. Кальпаиновый протеолиз

В условиях ишемии существует высокая вероятность задействования вторичного лизосомального механизма альтерации. Многие исследователи большое значение придают активным протеолитическим ферментам, которые высвобождаются из лизосом в результате повышенной проницаемости их мембран [39]. Среди таких энзимов – кальпаиновая система, в состав которой входит ряд цистеиновых протеаз, требующих активации катионами кальция. Семейство включает также не менее 8 изоформ фермента кальпостатина. Установлено, что кальпаины и кальпостатины присутствуют и в почечной ткани, в частности в эпителиоцитах канальциевого аппарата [40]. Спектр биологических эффектов кальпаина и кальпостатина в настоящее время изучен не полностью, однако уже доказано их влияние на состояние клеточных мембран, активность ряда ферментных систем, хемотаксис, пролиферацию, апоптоз.

Ишемически-реперфузионная гибель нефроцитов. Апоптоз

При необратимом целлюлярном повреждении любого генеза пораженная клетка погибает. Существует два варианта клеточной смерти – некроз и апоптоз. Принципиальное различие между ними заключается в том, что в первом случае деструктуризация умирающей клетки происходит на фоне повышенной проницаемости ее мембраны с высвобождением в интерстиций содержимого цитоплазмы и органелл, повреждением расположенных рядом структур и развитием воспаления; во втором – при полной сохранности целостности общеклеточной оболочки и изоляции факторов демонтажа клеточных компараментов до полного завершения процесса [41, 42].

Один и тот же стимул может индуцировать как некроз, так и апоптоз; каскады, ведущие к апоптическому или некротическому способу клеточной смерти, активируются практически одновременно [43, 44]. Одним из механизмов и признаков апоптоза, в том числе апоптоза эпителия проксимальных канальцев при ишемии-реперфузии, является конденсация хроматина и фрагментация ДНК за счет активации эндонуклеаз [45, 46]. Следовательно, ингибиторы эндонуклеазы могут остановить как фрагментацию, так и последующий апоптоз.

При гипоксически-реоксигенационных повреждениях наиболее частой формой клеточной смерти является некроз. Ишемия с последующей реперфузией свежеизолированных проксимальных канальцев крыс приводила к активации эндонуклеазы с молекулярной массой, равной 15кДа, разрыву цепей, фрагментации ядерной ДНК и некрозу эпителиоцитов tt. proxinales. Апоптоз как причина клеточной смерти в изучаемой ситуации исключался на основании результатов электронной и световой микроскопии [45].

Непосредственная реализация апоптического разрушения внутриклеточных структур осуществляется цистеиновыми протеазами (каспазами), эндонуклеазами, сериновыми и лизосомальными протеазами, активированными Ca++. Среди них основным эффектором являются каспазы 3, 6, 7. Это непосредственные исполнители апоптоза, всегда присутствующие в клетке в неактивном состоянии. Активированные эффекторные каспазы начинают цепь протеолитических событий, целью которых является «демонтаж» клетки. Их активируют индукторы активации эффекторных каспаз – каспазы 2, 8, 9, 10, механизм действия которых заключается в расщеплении аспарагиновых оснований с последующей димеризацией активных субъединиц. Индукторы активации эффекторных каспаз в неповрежденной клетке неактивны и существуют в форме прокаспаз.

Реализация митохондриально зависимого сигнального пути предполагает повышенную проницаемость мембран хондриосом и высвобождение из них ряда белков, некоторые из которых способны самостоятельно активировать каспазу 9. Среди них: голоцитохром С, новый белок с двойным именем Smac/Diablo, апоптозиндуцирующий фактор (AIF), ядерная эндонуклеаза G. Эти протеины не только активируют каспазы, но и индуцируют клеточную смерть каспазонезависмым способом [47, 48].

При гипоксически реоксигенационной необратимой альтерации эпителиоцитов канальциевого аппарата нефрона каспазы являются основным деструктурирующим агентом, о чем свидетельствуют результаты многих экспериментальных исследований.

При выполнении лапароскопической резекции пораженного фрагмента почки одним из вероятных негативных последствий вмешательства является дисфункция гломерулярно-тубулярной системы органа, связанная с вынужденной интраоперационной окклюзией почечной артерии. К первичным поражающим факторам относится ишемия и реперфузия ренальной паренхимы, объектом обратимой или летальной альтерации становятся действующие нефроциты. Ответ клеточных структур почечной ткани на повреждение является неспецифическим типовым патологическим процессом. В результате первичной альтерации развиваются гипоксия, гипоэргоз, повреждения ДНК, нарушение целостности биологических мембран, что приводит к активации вторичных, третичных и далее повреждающих механизмов. При летальных повреждениях нефроциты гибнут путем некроза и/или апоптоза. Программа апоптоза реализуется при появлении не подлежащих репарации повреждений ДНК или в результате активации рецепторов «региона клеточной смерти».

В случаях некроза разрушение клеток ренальной паренхимы происходит за счет электрического пробоя их мембран, вероятность реализации которого появляется в условиях инициации перекисного окисления липидов, активирования мембранных фосфолипаз, увеличения коллоидно-осмотического давления и набухания клетки, адсорбции на мембранах полиэлектролитов и структур белковой природы. Перспективными направлениями разработки новых методов эффективной нефропротекции при вынужденном интраоперационном обескровливании почки являются устранение гипоэргоза за счет вмешательства в пуриновый обмен, стабилизация биологических мембран, антиоксидантная и антигипоксическая защита нефроцитов, поддержание в неактивном состоянии или инактивация ферментов, демонтирующих внутриклеточные структуры, и др. Создание и внедрение новых технологий защиты и стимуляции ренальной ткани при лапароскопической резекции почки остаются актуальной проблемой и в настоящее время.