Большинство клеток человеческого организма имеет узкую специализацию, т. е. образуют какой-либо один тип клеток. Это обусловливает специфику формирования различных тканей и органов, обладающих особыми функциями. В организме человека таких клеток более 350 видов. В процессе эмбриогенеза, особенно на ранних стадиях, клетки организма еще не имеют узкой специализации, но способны дифференцироваться и быть родоначальником различных видов клеток. Такие клетки называются стволовыми. Они являются универсальным строительным материалом, из которого при соответствующем функциональном и анатомическом окружении на фоне специфических биохимических реакций дифференцируются любые клетки нашего организма [1].

Стволовые клетки (СК) – это отдельные клетки, или группа клеток-предшественников, обладающих
способностью к самообновлению и дифференцировке в специализированные ткани.

Эти клетки, среди них – прежде всего эмбриональные стволовые (ЭСК), оказались перспективными
не только для решения многих фундаментальных вопросов генетики и биологии развития, но и в практической биотехнологии, генной терапии, трансплантологии, гематологии, ветеринарии, фармакотоксикологии, при тестировании лекарств и в других областях. Если ЭСК выращивать в культуре, in vitro, из них возникают обычные стволовые (недифференцированные, самообновляющиеся) клетки, способные трансформироваться в разные типы клеток и тканей (кроветворные, половые, мышечные, нервные и др.) и длительное время сохраняться в условиях криоконсервации [2].

Отношение к проблеме изучения СК во всем мире неоднозначное. Общественное мнение варьируется
от официального разрешения на изучение данной проблемы до полного запрета – вплоть до угрозы
уголовного наказания. В Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации говорится:
"Интересы и благо отдельного человека должны превалировать над интересами общества и науки”.
В 18-й статье Конвенции о правах человека и биомедицине о таких исследованиях сказано следующее:
• в случаях, когда закон разрешает проведение исследований на эмбрионах in vitro, законом должна быть предусмотрена их адекватная защита;
• запрещается создание эмбрионов человека в исследовательских целях.

Во Франции рекомендуется с уважением относиться к эмбриону от момента его зачатия. В Великобритании, Канаде и Австралии разработана система законодательных актов, регулирующих
и контролирующаяих исследования с эмбрионами и эмбриональными тканями. В США подобные
работы проводятся только в частных фирмах, так как конгресс запрещает использовать для этой цели
федеральные средства [2]. В ряде стран разрешены исследования лишь на тех эмбрионах человека,
которые не востребованы после экстракорпорального оплодотворения, а также получение СК только
от криоконсервированных или переданных их “владельцами” эмбрионов человека при соблюдении
соответствующих правил [2].

Руководства и принципы исследований на эмбрионах человека детально обсуждаются группой по
этике в науке и новых технологиях Европейской комиссии, а также рабочими группами Руководящего
комитета по биоэтике в Совете Европы. Эти группы разрабатывают дополнительные протоколы к
Конвенции о правах человека и биомедицине [2].

В России при работе с СК руководствуются Основами законодательства РФ об охране здоровья
граждан, в которых предусмотрено создание регулирующих этических комитетов, Временной инструкцией о порядке исследований в области клеточных технологий и их использовании в учреждениях здравоохранения, разработанной Экспертным советом Минздрава России 18.04.02, а также законом Российской Федерации “О трансплантации органов и (или) тканей человека” от 25.07.2003 (1992) и приказом № 325 Минздрава РФ “О развитии клеточных технологий в Российской Федерации” [2, 3]. Кроме того, в 2002 г. принята отраслевая программа “Новые клеточные технологии – медицине”, рассчитанная на 8 лет, целью которой является разработка и широкое применение в России наукоемких и эффективных биомедицинских технологий, основанных на фундаментальных и прикладных исследованиях стволовых клеток, и создание необходимой для этого инфраструктуры [4].

В исследовательских целях разрешено применение эмбрионального материала человека с момента оплодотворения до 8-й недели включительно.

При использовании абортивного материала должны соблюдаться условия контроля возраста эмбрионов, а эмбриональные клетки должны извлекаться из неповрежденных зародышей. Использование в исследовательских целях жидкостей, оболочек, пуповинных и плацентарных тканей после рождения ребенка, а впоследствии применение выделенных клеток в терапевтической практике разрешены только при условии оформления письменного разрешения Минздрава России. Работа с донорским материалом должна проводиться по правилам, принятым при переливании крови и ее компонентов [3].

В литературе используется две классификации СК: по источнику происхождения клеток (эмбриональные, фетальные, клетки костного мозга, клетки пуповинной крови, СК тканей взрослого организма и т. д.) и по способности к дифференцировке: тотипотентные, образующие клетки любых типов; плюрипотентные, образующие клетки многих типов, но не всех; мультипотентные, образующие клетки нескольких типов, и унипотентные, образующие только один тип клеток [2].

Термин “стволовая клетка” введен в биологию русским гистологом А. А. Максимовым в 1908 г.
при исследовании процессов кроветворения. Он высказал гипотезу о существовании недифференцированных клеток, сохраняющихся в организме пожизненно, которые могли превращаться в лимфоциты и другие специализированные клетки соединительной ткани и крови. Клетки были названы по аналогии со строением дерева, т. е. ветками, растущими от одного ствола. Тогда в практической медицине широко использовалось направление, ставящее целью омоложение человеческого организма. Литературный герой М. Булгакова профессор Ф. Ф. Преображенский с этой целью пересаживал “яишники обезьяны”, а апофеозом романа явилась пересадка животному человеческого гипофиза. Следует отметить, что подобная практика действительно имела место в ряде клиник в 1920–1930-х гг. В частности, русский хирург Воронцов в Париже с целью омоложения пересаживал пациентам половые железы обезьян. Было отмечено выраженное омолаживающее действие от подобных вмешательств с кратковременным эффектом в течение нескольких недель. Каждая последующая операция давала менее выраженный эффект и в итоге наступало скорое старение пациента. В 1997 г. журнал “Тайм” посвятил этому специальную статью [5]. В СССР
академик В. Ф. Филатов с 1933 по 1969 г. успешно разрабатывал методы получения тканевых препаратов для стимуляции биосинтетических и обменных процессов, активации репаративных реакций в клетках стареющего организма [6]. В 1931 г. П. Ниханс в Швейцарии опубликовал ряд работ и основал клинику, занимавшуюся трансплантацией тканей, содержащих живые клетки. Использовалась пересадка паращитовидных желез крупного рогатого скота, как сообщалось, с положительным эффектом. Любопытно, что он трактовал результаты трансплантаций не как эффект воздействия гормонов (или стимулирующего воздействия трансплантированных активных факторов), а как восстановление в организме больного адекватных функций, которые выполняли поврежденные и удаленные в ходе операции клетки. Клиника Ниханса существует по сей день, с 1931 г. в ней выполнено свыше 50 тыс. операций [1, 7, 8].

Более активно трансплантация органов и тканей стала развиваться с 1950-х гг., когда начались работы по лечению пациентов с тяжелыми заболеваниями крови. В середине 1950-х гг. E. Thomas осуществил пересадку костного мозга от здоровой сестрыблизнеца девочке, перенесшей радиационное лечение острой анемии, с положительным результатом. В 1961 г. была выполнена первая пересадка фетальных гематогенных клеточных предшественников двум пациентам с апластической анемией. Начиная с 1970 г. стали появляться работы об успешных
трансплантациях островков Лангерганса крысам с экспериментальным диабетом [7]. В 1975 г. проведена первая успешная пересадка фетальных СК печени при врожденном синдроме дефицита островков Лангерганса. В СССР А. Я. Фриденштейн опубликовал ряд работ, посвященных изучению
плюрипотентных СК костного мозга и процессов их дифференцировки, получивших международное
признание. В частности, он отметил такое важное свойство мезенхимальных стволовых клеток (МСК),
как способность придерживаться, распространяться и развиваться на статической поверхности
(базальная мембрана органов или пластик in vitro) [9, 10].

В дальнейшем отмечен бурный рост числа выполняемых клеточных трансплантаций. В качестве
иллюстрации можно привести следующие данные: если в 1990 г. в 143 центрах Европы проведены 4234 трансплантаци гематогенных СК, то в 1994-м – 10 066 аналогичных трансплантаций в 306 научных центрах, расположенных в 30 странах. В середине 1990-х гг. количество трансплантаций гематогенных СК из 12 ведущих странах Европы достигло 16–17 операций на 1 млн человек [7].

Свойства СК:

• отсутствие специализации;
• способность к пролиферации с высоким потенциалом деления. Встречаются работы, в которых
авторы отмечают наблюдение более 100 циклов деления у СК без появления каких-либо дегенеративных изменений и снижения потенциала деления [11];
• способность к дифференцировке (специализированное направленное деление);
• способность к асимметричному делению (параллельное образование клеток, идентичных материнским и имеющих специализированные особенности);
• способность к стимуляции регенерации местных тканей в зоне трансплантации;
• способность к миграции в наиболее необходимые участки для их местной направленной дифференцировки (хоуминг);
• пластичность – способность некоторых СК дифференцироваться во многие типы клеток. Например,
гемопоэтические СК могут дифференцироваться в нейроны и другие клетки мозга, миоциты и клетки
печени, стромальные клетки костного мозга – в клетки сердечной и скелетной мускулатуры; мезенхимальные клетки могут давать начало остеоцитам, адипоцитам, хондроцитам и т. д.);
• способность придерживаться, распространяться и развиваться на статической поверхности, будь то
базальная мембрана органов или пластик in vitro [9];
• способность к регуляции местных и общих факторов иммунологической защиты [12];
• низкая антигенная активность, обусловленная не только отсутствием экспрессированных комплексов гистосовместимости, но и наличием ряда иммуносупрессорных белков [7];
• СК различных видов, действуя в качестве “одной трансплантируемой группы”, могут неоднократно
усиливать суммарный клинический эффект после трансплантации. Например, клетки Сертоли, окружающие мужские прогениторные половые клетки, нашли оригинальное применение в экспериментальной неврологии. Их смешивают с нейрональными СК при трансплантации. Выживаемость нервных СК в паре с клетками Сертоли возрастает в несколько раз за счет трофических и барьерных функций герминативной стромы [7].

Источники получения СК

1. Костный мозг (КМ) взрослого человека содержит гемопоэтические (1–2%) и стромальные (<0,05%)
стволовые/прогениторные клетки [13]. Из одного биоптата выделяют около 100 тыс. очищенных
МСК, которые за счет пассажей удается превратить в 500 млн незрелых клеток [7]. Кроветворные
клетки можно классифицировать на гематопоэтические СК (ГСК, hematopoietic stem cells),
обеспечивающие долговременную постоянную реконструкцию всей гемопоэтической системы, и прогениторные клетки, обусловливающие кратковременную (1—2 мес) реконструкцию [14].
Гематопоэтичекие СК дают начало разным росткам клеток, один из которых (эндотелиальный)
способен дифференцироваться в кардиомиоциты. Стромальные стволовые КМ-клетки включают
взрослые МСК и мультипотентные взрослые прогениторные клетки (mesenchymal progenitor cells),
причем клетки обоих типов способны к мультилинеарной дифференциации [14]. В культуре МСК
стабильно поддерживают недифференцированный фенотип. Эти клетки посредством 5-азоцитидина
либо ДНК-деметилирующих агентов можно индуцировать, например, к трансдифференциации в
кардиомиоциты. Таким образом, мононуклеарная фракция КМ содержит множество клеток, потенциально способных участвовать в восстановлении и регенерации поврежденного миокарда намного эффективнее, чем любые другие изолированные клеточные линии.

Мезенхимальные СК человека из КМ представляют полезную, легкодоступную и относительно
охарактеризованную популяцию для исследований мезенгенеза, и очевидно, что эти клетки могут
использоваться для аллогенной трансплантации. МСК человека экспрессируют небольшое количество молекул І класса главного комплекса гистосовместимости (MHC) и почти не экспрессируют
молекулы II класса MHC и В7-костимулирующие молекулы, играющие важную роль в инициации антигенспецифического иммунного ответа. Эксперименты in vitro с лимфоцитами от разных
доноров свидетельствуют о том, что МСК человека не вызывают пролиферации Т-клеток и на самом
деле могут подавлять смешанную лимфоцитарную реакцию, что в свою очередь говорит в пользу
клинического использования аллогенных МСК человека [15].

2. Пуповинная кровь (ПК). Многочисленные исследования показали, что ПК является богатым источником ГСК [16–18]. Установлено также, что лимфоидные клетки ПК менее иммунореактивны,
поэтому частичная несовместимость по антигенам HLA-системы при трансплантации гемопоэтических клеток допустима, а частота тяжелой иммунной реакции “трансплантат против хозяина”
(РТПХ) встречается реже, чем при трансплантации клеток КМ [18]. При этом приживаемость
трансплантата ПК не ниже, чем КМ – даже при использовании меньшего числа вводимых гемопоэтических клеток из расчета на 1 кг массы тела больного. Однако вопрос об оптимальном количестве трансплантируемых клеток ПК, необходимых для приживления в организме реципиента,
до сих пор окончательно не решен. Сбор ПК осуществляется после рождения ребенка и отделения
его от последа, когда плацента еще находится in utero или после ее рождения – ex utero, а также при
кесаревом сечении (ex utero). F. Bertolini и cоавт. [17] установили, что если с момента рождения до
отделения новорожденного от плаценты проходит не более 30 с, собираемый объем крови в среднем
на 25–40 мл больше, чем при более позднем отделении ребенка. Ими также отмечено, что раннее
отделение ребенка от последа не влечет за собой каких-либо отрицательных последствий для новорожденного.

Следует отметить, что использование ПК для пересадок имеет ряд преимуществ перед другими источниками кроветворных клеток:
• отсутствует риск для здоровья матери и ребенка (донора) и не требуется общей анестезии при сборе
ПК;
• появляется возможность длительного хранения гемопоэтических клеток как аллогенного трансплантата в замороженном состоянии;
• имеется бóльшая возможность использования не полностью совместимых по HLA-системе (от 1 до
3 антигенов) трансплантатов;
• увеличивается вероятность нахождения редких HLA-типов трансплантатов, что очень важно для
некоторых этнических меньшинств;
• значительно снижается риск передачи некоторых трансмиссивных латентных инфекций;
• требуются меньшие затраты времени для поиска необходимого HLA-типа трансплантата;
• появляется недорогая форма биологического страхования жизни в связи с возможностью использовать клетки ПК в качестве аутологичного трансплантата [19].

Принципиальные различия между СК костного мозга и СК из ПК заключаются прежде всего в
количестве получаемых при одном сборе гемопоэтических клеток, используемых в дальнейшем для трансплантации. Если для КМ потери клеточной массы в процессе сепарации, криоконсервирования, размораживания и тестирования допустимы в пределах 40–50%, то для ПК такие потери клеток не
допустимы, так как при пересадке может возникать несостоятельность трансплантата. Так, по данным
G. Kogler и соавт. [20], для трансплантаций при массе тела реципиента 10 кг (из общей численно
сти 2098 собранных образцов ПК) потенциальными трансплантатами могут быть все образцы ПК, при
массе 35 кг – 67%, и лишь 25% образцов смогут обеспечить больных с массой тела 50–70 кг.

3. Цельная кровь. Количество содержащихся в цельной крови СК меньше, чем, например, в ПК или
КМ, и культивирование их является процессом трудоемким и часто нерентабельным. Незрелые
стромальные (СD34-) клетки выявлены в циркулирующей крови. Таких клеток в КМ многим
меньше, чем CD34+-предшественников (1 клетка на 1 млн клеток КМ) [21, 22]. В культуре эти клетки
прикрепляются к подложке, формируя островки фибробластоподобных клеток. В незрелом состоянии клетки пролиферируют в течение нескольких пассажей, сохраняя плюрипотентность (способность к дифференцировке в линии адипоцитов, миофибробластов, стромы гематогенной ткани, клетки хряща и кости). Ограниченная популяция СD34--стромальных клеток из кровотока возвращается в строму костномозговой ткани, где трансформируется в линии CD34+-гематогенных СК. Эти наблюдения позволили заключить, что посредством рециркуляции прогениторных мезенхимальных клеток в кровотоке поддерживается баланс СК в разных органах через общий пул клеток [21, 22].

4. Эмбриональные и фетальные ткани. Эмбриональные СК выделяют из эмбрионов ранних стадий развития. На стадии бластоцисты зародыш состоит из 70 трофобластных клеток и около 30 клеток
внутренней клеточной массы бластулы — эмбриобласта. Именно последние являются плюрипотентными СК, дающими начало всем клеточным типам основных зародышевых листков эмбриона — эктодерме, мезодерме и эндодерме. Сейчас стало возможным выделить эти СК из бластоцисты новым методом иммунохирургии — путем лизиса трофобластных клеток определенными молекулами иммунной системы, а клетки эмбриобласта – поддерживать в недифференцированном состоянии в культуре в виде клеточных линий. Выделены также эмбриональные половые клетки (primordial germ cells, embryonic germ cells) из развивающегося полового бугорка [23].

Анатомо-физиологическая и биохимическая
ниша СК

С момента открытия и идентификации СК вопрос о наличии факторов, позволяющих этим клеткам направленно и одновременно асинхронно дифференцироваться в те или иные формы, по сей день
остается открытым. Гипотеза существования анатомо-физиологических и биохимических ниш СК,
предложенная Schofield почти 30 лет назад (1978), с общепринятой точки зрения на сегодняшний
день является наиболее удобной, позволяет наиболее полно объяснить клеточные взаимоотношения,
приводящие к дифференцировке [24]. Их природа наиболее полно исследована при изучении гемопоэза [25] и подтверждена работами в других областях [26, 27]. Отмечено, что строма и стромальные ячейки вместе обеспечивают физическую поддержку предшественникам созревания специализированных клеток и служат архивом широкого диапазона полученных ячейкой копий и сигналов, ведущих к возникновению новых клеток, способствуют их дальнейшей дифференцировке и созреванию [27].

Анатомо-физиологическая и биохимическая ниша СК – это особенные условия и взаимоотношения
клеточной микросреды (клеточные, биохимические и молекулярные), обеспечивающие существование
и течение биологических процессов, необходимых для существования и функционирования СК. Ниша
сохраняет СК от истощения, регулируя их дифференцировку, и является основным модулем физиологии
ткани, объединяя сигналы, которые добиваются сбалансированного клеточного ответа на потребности
органа-мишени. Изменения условий ниши ведут к нарушениям процессов дифференцировки, так
как СК и ниши составляют динамическую систему, определяющую регенеративные способности тканей
организма. В цитобиологии ниша рассматривается по биологическим линиям. Простого выявления СК
не достаточно для того, чтобы определить нишу. Ниша имеет анатомические и функциональные
измерения, создает условия для жизнедеятельности СК. Условия ниши определяют функцию СК [28].

Для каждого вида СК ниша уникальна, при этом для направленного деления на различные типы клеток может быть использована одна и та же ниша. Например, в КМ физиологическое соседство мезенхимальных и гематопоэтических клеток часто приводит к тому, что для направленной дифференцировки разных типов клеток используются одни и те же ниши. В данном случае направление дифференцировки определяют внеклеточные и межклеточные сигналы, являющиеся различными для разных типов клеток [24]. Отмечено, что СК определяются в различных органах и тканях, функционируют везде, где в естественных условиях или in vitro для них формируются ниши [24, 26–28].

Выявление СК, существующих вне ниш, позволило выдвинуть концепцию о существовании внеклеточной матрицы. Стволовые клетки и внеклеточно-матричные компоненты ниши предсказуемы, хотя процессы их взаимодействия не совсем понятны. В семенниках мухи дрозофилы компонент UPD
вызывает дифференцировку стромальных СК (ССК) через киназу Джанаса (JAK) – преобразователь сигналов и активатор транскрипции (STAT) [28].

Потенциал дифференцировки

Вопрос об абсолютном потенциале самообновления СК на сегодняшний день является открытым. Какой-либо линейной зависимости активности дифференцировки СК не существует. Потенциал
дифференцировки зависит от воздействия внешних факторов, что подтверждается в опытах in vitro,
когда введение активаторов роста, например фактора роста фибробластов FGF-2, к основной среде
приводит к удвоению митотической активности СК [29]. Сомнительно, что митотическая активность
и дифференцировка зависят от воздействия какого-либо одного стимулирующего или тормозящего
фактора. Сложность дифференцировки, в частности асимметричная дифференцировка, подразумевает воздействие нескольких факторов, что было подтверждено в работе [30].

У различных биологических видов, будь то человек, кролик или крыса, одни и те же виды СК в пробирке или в естественных условиях в зависимости от факторов микроокружения дифференцируются только в определенные типы клеток. Следовательно, СК обладают гетерогенным потенциалом дифференцировки. Одна клетка в результате разных митозов способна дать потомство как не похожее на саму себя, так и различающееся видами дочерних клеток. Ее потомки могут принадлежать разным видам. Возникает закономерный вопрос: все ли СК обладают подобным свойством? M. Pittinger и соавт. [31] сообщили, что в исследованной ими популяции МСК только около 30% являлись плюрипотентными, основная же масса могла образовать только один или два вида
клеток разных видов. С. А. Кузнецов и соавт. [32] отметили, что у иммунодефицитных животных только 58,8% имеющихся СК обладали митотической активностью при регенерации костного материала.
Соответственно, чем мощнее клетка, чем большую активность к мультивидовой дифференцировке она
может проявить, тем реже она встречается. Кроме того, можно предположить, что эти клетки обладают низкой дифференцирующей активностью по времени, а суммарный срок их активной митотической жизнедеятельности небольшой. Основную нагрузку несут мульти- и унипотентные клетки. Добавление же FGF-2 ведет к активации всех подгрупп МСК, причем в наибольшей степени тех, которые обладают более высоким ростовым потенциалом [33]. Регуляция дифференцировки биохимическим путем и методами генной инженерии Примеры монофакторно управляемой дифференцировки ЭСК весьма немногочисленны: в узком диапазоне концентраций ретиноевая кислота индуцирует нейрогенез; ВМР-2 – образование эпителия энтодермы; трансформирующий фактор роста β (TGFβ) – направленную дифференцировку ЭСК, преимущественно в мышечные линии; IL-6 – направленную дифференцировку ЭСК, преимущественно в эритроидные линии; IL-3 –направленную дифференцировку ЭСК, преимущественно в моноцитарно-миелоидные линии [7].

Для объяснения процессов направленной дифференцировки интересна модель, предложенная
D. Baksh и соавт. [24]. На первом этапе СК подвергаются транскрипционной модификации, производя
аналогичные клетки без очевидных фенотипических изменений и способности к дифференцировке.
Эта функция направлена на поддержание регенераторного пула СК, обеспечивающего резервы СК
в тканях. Подобные клетки постоянно находятся в КМ взрослой особи любого вида в неподвижном состоянии без признаков дифференцирования и активируются только при добавлении факторов роста. При добавлении FGF-2 (второй этап) наблюдается асимметричное деление этих клеток.
Одна дублирует материнскую, вторая же становится клеткой-предшественником с более ограниченными возможностями к дифференцировке. Клетка-предшественник продолжает делиться, образуя мультипотентные клетки, которые морфологически напоминают мезенхимальные клетки, но отличаются от них по репертуару транскрипции гена и поэтому продолжают занимать оставленную для них нишу. Полученные клетки делятся симметрично, производя унипотентные клетки, которые приобретают специфические свойства на пути к формированию клеток с различными фенотипами.

Механизм регуляции, обеспечиваемый межклеточным взаимодействием и ростовыми факторами,
остается не до конца изученным. Установлено, что в процессах регуляции играют роль факторы транскрипции, цитокины, факторы роста и внеклеточные матричные молекулы [24]. В настоящее время идентифицированы локусы генов, которые определяют дифференцировку и регулируют остеогенез, адипогенез и хондрогенез [34], но те же исследователи не смогли выявить локусы, ответственные за дифференцировку более чем по одному направлению, т. е. главные гены управления. В работе, которая посвящена 39 тыс. расшифровок человеческого генома U133, сообщается, что участки, состоящие из 914, 947 и 52 генов, определяют дифференцировку унипотентных МСК, а локусы, состоящие из 235, 3 и 10 генов, отвечают за дифференцировку клеток по двум направлениям (например, остео- и хондроциты). Наиболее интересна группа, состоящая из
8 генов, стимулирующая роль которых проявилась в дифференцировке мезенхимальных клеток по 3
направлениям, поэтому она более или менее напоминает “главные гены управления”. К ним относятся рeriod gomolog 1 (PER 1), nebulette (NEBL), молекула прилипания ячейки нейронала (NRCAM), FK506-связывающий протеин 5 (FKBP5), интерлейкин-1 для 2-го типа рецепторов (IL1R2), zinc finger protein 145 (ZNF145), тканевой ингибитор металлопротеиназы 4 (TIMP4) и serum amyloid A2. Функция этих генов охватывает широкую область клеточных процессов, таких как фиксация клетки, глобуляция белка, формирование актинового цитоскелета и формирование стимулирующего потенциала деления [24]. Таким образом, стимуляция клеточной дифференцировки является сложным процессом,
требующим взаимодействия множества факторов. Например, чтобы in vitro получить остеоцит, необходимо наличие мультипотентной СК, которая в результате асимметричного деления образует клетку-остеопредшественник, который в свою очередь путем симметричного деления образует остеопрогенитор, затем проостеобласт, функциональный остеобласт и в конечном итоге – остеоцит. Эта цепочка невозможна без своевременной активации и депрессии факторов транскрипции, а именно Cbal/Runx2, Msx2, Dlx5, Osx, и активации связанных с костью генов маркера, т.е. остеопоэтина, щелочной фосфатазы, сиаловых остеопротеинов и остеокальцина. Кроме того, отмечена роль Wnt-гликопротеинов, богатых цистеином, которые активно участвуют в остеогенезе во время эмбрионального развития и оказывают стимулирующий эффект [24, 35]. Нарушение этой цепочки ведет к формированию элементов незавершенного остеогенеза.

Логично, что следующим шагом в применении клеточной терапии было создание СК с генетически
запрограммированной ДНК для направленной дифференцировки. Встречаются работы [36], в которых
авторы, используя вирусную трансдукцию, добивались появления клеток, обладающих способностью к
активной дифференцировке и низкой смертностью. Традиционные методы трансфекции, такие как преципитация фосфата кальция, липофекция и электропорация, не могут считаться эффективными при установке плазмиды в ДНК МСК, так как эффект не превышает 1% [20]. Для подобных работ в настоящее время используются такие методы, как нуклеофекция™ (“Amaxa Biosystems”), трансфекция на основе вибрации (Synphonizer™, Mollennium Inc., Япония) и метод nonvirally transfecting cells. По некоторым данным, их эффективность достигает 80% по сравнению с традиционными методами [36].
Интересна работа J. Simonsen и соавт. [37], в которой сообщается, что при добавлении к культуральной среде человеческого фермента транскриптазы, заменяющего теломеразу (hTER), увеличивается число митозов более чем на 260 для каждой клетки. Tenascin C повышает чувствительность СК к фактору роста фибробластов (FGF-2), увеличивая их способность к глиальной дифференцировке [28].

Таким образом, на сегодняшний день имеются реальные возможности для направленной дифференцировки СК биохимическим путем и методами генной инженерии.

Иммунологические аспекты трансплантации МСК

Мезенхимальные СК костного мозга стимулируют дифференцировку разных популяций Т-лимфоцитов
(CD4+-, CD8+-, Е-клеток памяти), специфически взаимодействуя как с собственными иммунокомпетентными клетками, так и с клетками реципиента при аллогенных трансплантациях, что обусловливает активное применение клеточных технологий в клинической практике [38]. Мезенхимальные СК не лизируются в смешанных культурах аллогенными ядросодержащими клетками периферической крови или Т-лимфоцитами и NK-клетками, значительно ингибируют пролиферацию Т-лимфоцитов в ответ на активацию поликлональными стимуляторами (например, фитогемагглютинином, антиCD3-антителами или профессиональными антигенпрезентирующими клетками. Эффект, как правило, обратим [39]. Встречаются работы, в которых сообщается о зависимости ингибирования пролиферации Т-лимфоцитов от количества взаимодействующих с ними МСК. Эффект ингибирования возникает при соотношении МСК:лимфоциты, равном 1:10 или 1:100, причем этот эффект является универсальным независимо от биологического вида. Супрессивный лимфоцитарный эффект МСК может быть усилен добавлением γ-интерферона [39], в то время как введение IL-2 частично ослабляет ингибирование пролиферации [40]. Вопрос о степени влияния и длительности его в настоящее время остается дискутабельным ввиду противоречивых данных.

Мезенхимальные СК, дифференцирующиеся в течение 1—2 нед в остеогенном, хондрогенном
и адипоцитогенном направлениях, не повергаясь лизису в смешанных культурах, сохраняют иммуносупрессивные свойства [12, 39]. Встречаются работы, в которых подтверждается сохранение клеток в течение 13 мес в органах хозяина в отсутствие иммуносупрессии [32]. Мезенхимальные СК благоприятно влияют на приживление несовместимого органа при их совместной трансплантации. Предварительное введение МСК способно увеличивать выживаемость аллогенного кожного трансплантата у обезьян [40]. Этот эффект наблюдался только при условии изогенного происхождения МСК и кожного трансплантата. Интересен факт опухолевого роста клеток меланомы при их совместном подкожном введении с ССК/МСК в организм мыши, тогда как без МСК клетки меланомы быстро отторгались [41].

Возможные механизмы иммунологических эффектов, опосредованных МСК:
• активация Т-клеточного рецептора лимфоцитов реципиента (TCR-CD3) без сопутствующей СD28-
костимуляциии;
• взаимодействие неизвестных поверхностных молекул;
• секреция ССК/МСК простагландина E2 (PGE2);
• индукция экспрессии в ССК/МСК фермента indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO), который катализирует конверсию триптофана в kynurenine;
• секреция ССК/МСК TGFβ и фактора роста гепатоцитов (HGF);
• секреция ССК/МСК неизвестного растворимого посредника с выраженной иммуносупрессивной
активностью [12].

Вопрос о превалирующей роли клеточно-клеточных контактов, обусловливающих наличие иммунологических характеристик СК, в настоящее время остается дискутабельным. Мезенхимальные СК
ингибируют дифференцировку моноцитов разными способами в зависимости от соотношения культивируемых клеток [42]. При высоком соотношении (1:10) основную роль играют растворимые факторы, тогда как при низком разведении (1:40) необходимо наличие клеточно-клеточных контактов. Реализация иммунологических свойств МСК, по-видимому, обеспечивается опосредованным клеточно-клеточным взаимодействием и секрецией растворимых факторов [12].

Мезенхимальные СК человека характеризуются отсутствием экспрессии костимулирующих молекул B7-1, B7-2 и CD40 [40]. Контакт Т-клеточного рецептора и молекул главного комплекса гистосовместимости (молекул MHC) в отсутствие костимулирующего сигнала приводит к состоянию анергии Т-лимфоцитов [43].

Так как взаимодействие является антигенспецифичным, анергичной становится только определенная субпопуляция Т-лимфоцитов, за счет чего достигается толерантность ко всем клеткам одного происхождения. Этот механизм не может участвовать в супрессии пролиферации Т-клеток в реакции
смешанной культуры лимфоцитов, но вполне объясняет длительную выживаемость кожного аллотрансплантата у приматов [40].

В настоящий момент получены противоречивые данные при идентификации конкретного растворимого посредника иммуносупрессивных эффектов МСК. Обнаружено, что PGE2, секретируемый ССК/МСК, был частично ответствен за опосредованные МСК-иммуномодулирующие эффекты, так как они блокировались двумя разными ингибиторами PGE2 [12, 44]. При использовании нейтрализующих моноклональных антител показана иммуносупрессивная роль HGF [45]. Эти работы предоставляют почву для дальнейших исследований, так как большинство аналогичных посредников иммуносупрессии в настоящее время не открыто.

Применение трансплантации МСК в клинической практике

С учетом высокого регенераторного потенциала и множественных трансплантационных эффектов
СК в настоящее время их используют в различных областях клинической медицины. Например,
трансплантация КМ, ранее приравниваемая к пересадке органа и выполняемая только в крупных трансплантационных центрах, в последние годы видоизменилась до трансплантации гемопоэтических клеток и стала самым широко применяемым методом клеточной трансплантации в клинической практике.

В одной из работ [46] нам встретилась удобная, с нашей точки зрения, классификация использования
клеточных технологий в клинической практике. Широкое клиническое применение (методы, прошедшие клинические испытания и доказавшие свою эффективность, выполняемые во многих медицинских центрах):
• аллогенная трансплантация гемопоэтических клеток (КМ, пуповинной и мобилизованной периферической крови) в гематологии, включая онкогематологию [46, 47];
• трансплантация (аллогенная и ксеногенная) островковых клеток поджелудочной железы при
сахарном диабете [48];
• аутогенная трансплантация хондроцитов при посттравматических повреждениях хряща коленного
сустава [47];
• трансплантация аутологичных и аллогенных фибробластов для лечения косметических дефектов кожи и трофических язв [49].

Ограниченное клинические применение (методы, показавшие свою клиническую эффективность в ряде исследований, но широкое применение которых ограничено в связи с остановкой испытаний, сложностью выполнения, законодательством и этическими соображениями в различных странах):
• аллогенная трансплантация гепатоцитов при врожденных метаболических дефектах у детей и печеночной недостаточности, при тяжелой энцефалопатии и при ожидании донорского органа [50];
• трансплантация аллогенных нейрональных клеток при лечении болезни Паркинсона [51].

Клинические испытания (I–III фаза) ( методы успешной трансплантации, находящиеся на различных
стадиях клинических испытаний или к началу набора пациентов одобренные Управлением по продуктам и лекарствам [FDA] или другими организациями более чем в двух центрах различных стран мира):
• аутогенная трансплантация гемопоэтических клеток мобилизованной крови при заболеваниях с
преимущественно аутоиммунным патогенезом (рассеянный склероз, системная красная волчанка, болезнь Крона, резистентный ювенильный ревматоидный артрит) [52];
• трансплантация гемопоэтических клеток в комплексном лечении солидных опухолей (рак почки,
молочной железы, поджелудочной железы, головного мозга) [53];
• трансплантация аллогенных МСК для профилактики РТПХ после предшествующей трансплантации гемопоэтических клеток [12, 54];
• адаптивная иммунотерапия (цитотоксические Т-лимфоциты и NK-клетки) в онкологии, клеточные онковакцины (на основе дендритных клеток) [55];
• клеточная кардиомиопластика (миобласты скелетной мышечной ткани, ядросодержащие клетки
КМ, CD34+- и CD133+-клетки КМ и мобилизованной периферической крови, аллогенные мезенхимальные клетки КМ) [56];
• трансплантация аутологичных гемопоэтических клеток при первичном амилоидозе [57];
• местная аутогенная трансплантация клеток КМ при асептическом некрозе головки бедренной кости [58];
• трансплантация нейрональных клеток (из линии тератокарциномы) пациентам в постинсультном
состоянии [59];
• трансплантация аутологичных мезенхимальных (стромальных) клеток КМ при дефекте хряща коленного сустава [7, 60];
• трансплантация аллогенных нейрональных клеток при болезни Хантингтона [61];
• трансплантация аллогенных и аутологичных клеток КМ (мононуклеарных и мезенхимальных) для
оптимизации регенерации костной ткани после переломов [62];
• трансплантация нейрональных СК в мозг крыс, подвергавшихся острой гипоксии, и при травме
спинного мозга [63, 64];
• трансплантация нейрональных СК при нейросенсорной тугоухости [63], эпилепсии [65];
• при лечении инсулинзависимого сахарного диабета [66, 67] и диабетической стопе [68];
• трансплантация мононуклеаров КМ при ишемической болезни нижних конечностей [69], болезни
Бюргера [70];
• трансплантация фетальных клеток печени человека для лечения ишемической болезни сердца и
генмодифицированных гепатоцитов для лечения семейной гиперхолестеролемии [71, 72].
• трансплантация при длительно незаживающих раневых поверхностях, трофических и лучевых
язвах, ожогах [64, 73];
• при хроническом пародонтите [74];
• трансплантация нормальных миобластов в мышцы пациентов с мышечной дистрофией Дюшенна
7];
• трансплантация человеческого фетального или трупного ретинального пигментного эпителия в субмакулярное пространство пациентов со старческой макулярной дегенерацией [7];
• трансплантация фетальной спинальной ткани в хроническую кисту для уменьшения размера очага
сирингомиелии [7];
• трансплантация кроветворных фетальных клеток в лечении язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки [75].

Интересно применение трансплантации культур СК для лечения иммунной РТПХ. В Швеции 9-летнему мальчику, страдавшему острой формой лимфобластного лейкоза и перенесшему аллотрансплантацию гемопоэтических клеток, с целью лечения РТПХ IV степени тяжести была выполнена инфузия аллогенных ССК/МСК от матери. При исследовании иммуносупрессивной активности ССК/МСК матери
в культуре оказалось, что эти клетки на 90% ингибируют пролиферативную активность лимфоцитов
первого аллогенного трансплантата. Благодаря такой трансплантации гемопоэз мальчика восстановился. При сохранении остаточных гематологических признаках РТПХ он имеет хорошие показатели качества жизни [39].

Перспективным направлением в лечении заболеваний с преимущественно аутоиммунным патогенезом являются работы по трансплантации КМ в моделях артрита и системной красной волчанки [76]. Как известно, от первых экспериментальных исследований до окончания клинических испытаний нового метода проходит 5—10 лет, поэтому о клинической эффективности многих методов клеточной трансплантации говорить еще рано. В настоящее время продолжаются испытания по оптимизации протоколов тех методов, которые уже активно применяются в клинике. Кроме того, продолжают
появляться работы о доклинических испытаниях методов клеточной трансплантации на различных
моделях болезней человека. Огромный интерес биологов и врачей к трансплантации клеток указывает
на перспективность и большие надежды, возлагаемые на эти методы.

Осложнения клеточной трансплантации

Наиболее значительными рисками использования ЭСК в практической медицине являются образование опухолей и иммунное отторжение.

Как известно, ЭСК человека, имплантированные мышам, могут дать начало опухолям мягких тканей.
Предположительно такой ответ связан с плюрипотентностью недифференцированных клеток in vivo.
Хотя есть работы, в которых не обнаружено статистически достоверного увеличения частоты образования опухолей [77]. На потенциальный риск канцерогенеза из СК взрослого человека после их трансплантации указывает тот факт, что они экспрессируют маркеры, общие для ЭСК и многих злокачественных линий [78]. Кроме того, из многих злокачественных новообразований человека были выделены и охарактеризованы так называемые инициирующие опухоль клетки, которые, как оказалось, имеют общие характеристики (маркеры) с нормальными СК взрослого человека [79]. Как выяснилось, полученные данные по поводу онкогенной активности трансплантируемых клеток не являются однозначными. D. Rubio и соавт. [80] описали популяцию мультипотентных МСК (ММСК) человека, выделенную из подкожной жировой клетчатки, демонстрирующую злокачественные характеристики [80]. В культуре CD13+/CD90+/CD105+/CD106+-ММСК после 2-месячного пассирования (более 20 делений) стали появляться трансформированные клетки, характеризующиеся высокой способностью к канцерогенезу у 100% мышей-реципиентов [81]. CD133+-клетки вызывали развитие бластом с мощнейшим метастазированием (преимущественно в легких, печени и канцероматоз брюшины) у облученных мышей через 4–6 нед после интраперитонеальной и внутривенной трансплантации 2,5–10,0 млн клеток в 10 из 13 и в 3 из 12 случаев соответственно, и у 100% животных — через 8 нед [82]. Общая биологическая способность ММСК к онкогенетической трансформации остается дискутабельной. Так, было показано, что ММСК костного мозга человека легко иммортализуются и после 256 удвоений дают рост опухолей in vivo в 100% случаев [83]. С другой стороны, группа Kassem (2002) при длительном пассировании ММСК, выделенных из КМ человека, не получила никаких признаков иммортализации после 40 удвоений [81]. Интересно, что ММСК мыши также подвержены спонтанной трансформации в культуре и демонстрируют сходную с человеческими ММСК злокачественность in vivo [80].

В литературе представлены данные и о других осложнениях трансплантации СК. Клинические
осложнения: иммунологические реакции, анафилаксия [84]; клеточная (тканевая) эмболия [85]; осложнения, связанные с токсичностью криопротектора [87]. Осложнения, описанные в экспериментальных исследованиях и потенциально опасные в клинике: образование опухолей [82, 83]; тканевая эмболия и микроинфаркты органов [86]; тканевая эмболия и микроинфаркты органов [86]; эктопическая оссификация [88]; фиброз и образование рубца [89]. Эти осложнения встречаются гораздо реже, и частота их развития сопоставима с таковой подобных осложнений при использовании других методов лечения.

Таким образом, трансплантация СК на сегодняшний день является перспективным методом, используемым в различных областях медицины. Несмотря на определенные сложности в его применении и многие юридические нюансы по его законодательному обеспечению, метод обещает в будущем открыть блестящие перспективы, которые будут использованы для лечения и профилактики многих заболеваний.