Введение. Бактерии, связанные с организмом человека, вновь стали объектом пристального внимания после получения результатов генетического изучения микрофлоры (микробиоты). Анализ микробиоты показал, что большая ее часть неизвестна и существующие методы выделения чистых культур бактерий в сумме позволяют получить лишь небольшую часть от общего состава микробиоты [1]. Такие бактерии, гены которых можно выявить, а методы выделения чистых культур еще не определены, получили название «пока не культивируемых». Причем подобные микроорганизмы обнаружены и среди патогенных бактерий [2, 3]. Поскольку именно человек является экологической нишей для большинства патогенных и условно-патогенных бактерий, вызывающих его болезни, очевидно, что список возбудителей неполный даже при тех заболеваниях, для которых микробная природа давно известна.

Целью настоящей работы было изучить микробный состав проб мочи, полученных от больного острым циститом, стандартными методами лабораторного исследования и с использованием метагеномной технологии.

Материалы и методы. Материалом для исследования служила моча больной острым циститом 45 лет. Время между забором материала и включением его в исследование не превысило 24 ч с хранением при 4°С.

Использованы питательные среды уриселект 4 («Биорад», Франция) и Колумбийский агар («BioMerie», Франция).

Биохимическую активность микроорганизмов определили с помощью системы Vitek 2 («bioMerieux», Франция).

ДНК из патологического материала и выросших на среде бактерий выделили при помощи стандартного набора ДНК сорб-В (Россия) согласно протоколу. Амплификацию осуществляли, используя эубактериальные праймеры 27F–534R, фланкирующие гипервариабельный участок гена 16S рРНК.

27F: ‘5-AGAGTTTGATYMTGGCTCAG-3’

534R: ‘5-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’.

Используемая в работе пара олигонуклеотидных праймеров специфична консервативным участкам гена 16S рРНК и применяется в метагеномных исследованиях для выявления бактериального разнообразия различных сообществ [4]. Метагеномное секвенирование фрагмента гена 16S pРНК выполнено на пиросеквенаторе Roche/454 Genome Sequencer FLX Titanium. Максимальная длина полученных последовательностей составила 507 нуклеотидов, химерные последовательности и последовательности короче 300 нуклеотидов в анализ не включали.

Анализ разнообразия и таксономического состава. Каждая полученная в ходе пиросеквенирования последовательность была идентифицирована путем сравнения с последовательностями баз данных GenBank и EzTaxon, с использованием алгоритмов BLAST-поиска и попарного сравнения [5]. Для определения видового разнообразия, таксономического состава и сравнения сообществ применили программу Pyrosequencing pipeline (http://pyro.cme.msu.edu). Полученные последовательности выравнили и провели кластерный анализ с помощью программы Complete Linkage Clustering, входящей в состав Pyrosequencing pipeline. Кластеризация осуществлена на разных уровнях, характеризовавшихся различными расстояниями между кластерами (от 0 до 0,25 с шагом 0,01). Выделение филотипов (OTU) проводили при кластерном расстоянии 0,03; оценку таксономической сложности сообществ – при уровнях различий, соответствоваших следующим таксонам: вид – 0,03, род – 0,05, семейство – 0,1, использовав программу Rarefaction (Pyrosequencing pipeline). Для характеристики таксономического состава сообществ был проведен кластерный анализ с параметром расстояния 0,25. Далее для каждого кластера с помощью программы Dereplicate Request выбирали нуклеотидную последовательность, соответствовавшую центру кластера, имевшую минимальную сумму квадратов расстояний до других входящих в кластер последовательностей. Репрезентативные последовательности кластеров таксономически классифицировали. Классификация видов на всех этапах работы проведена на основе генотипического подхода в соответствии с международным кодом номенклатуры бактерий (ICNB). В случае если репрезентативная последовательность имела гомологию более 97% с последовательностью валидированного микроорганизма, кластер относили к соответствующему виду.

Результаты. Стандартное лабораторное бактериологическое исследование выявило в патологическом материале кишечную палочку, давно известную как один из возбудителей заболеваний мочевыделительной системы. Изолированный штамм чувствителен ко всем антибиотикам, использованным при тестировании.

В результате метагеномного анализа установлено значительное видовое разнообразие бактерий. В патологическом материале выявлены бактерии, принадлежавшие к 1 семейству, 3 родам и 4 видам. Были представлены грамотрицательные бактерии семейства Enterobacteriaceae (см. таблицу).

Большинство бактерий, обнаруженных в пробе мочи при метагеномном анализе, ранее описаны как возбудители болезней растений и позже – людей. Возбудителями оппортунистических инфекций считаются E. cloacae, E. hormaechei [6–11]. Бактерии рода Shigella привычно воспринимаются как возбудители кишечных инфекций. Вместе с тем представители этого рода описаны как причина заболеваний мочевой системы [12].

Все эти штаммы, кроме кишечной палочки, не были получены в виде чистых культур в ходе выделения и идентификации возбудителя, проведенных стандартными лабораторными методами. В микробиологии уже давно достигнуто понимание того, что большая часть бактерий, входящая в микробиоту и вызывающая заболевания человека, относится к пока не культивируемым бактериям. Такие пока не культивируемые бактерии, тем не менее, принимают участие в развитии патологического процесса, и их присутствие необходимо учитывать при выборе антимикробной терапии. Отсутствие чистых культур большинства пока не культивируемых бактерий не позволяет оценивать их чувствительность к антибиотикам. Вместе с тем известно, что E. hormaechei и E. cloacae почти всегда устойчивы к ампициллину и цефалоспоринам [10, 11, 13]. Для шигелл также показано распространение устойчивости к антибиотикам [14].

Полученные данные свидетельствуют о том, что используемые стандартные методы лабораторной диагностики пока не позволяют изолировать и изучать все бактерии, находящиеся в патологическом материале и, скорее всего, в очаге инфекции. Основной причиной ограниченных возможностей стандартных лабораторных методов следует считать широкое распространение пока не культивируемых бактерий. Чаще всего такие бактерии дают рост при совместном выращивании в составе смешанных сообществ, где бактерии предоставляют друг другу определенные факторы, без которых каждый по отдельности расти не способен [15, 16]. Результаты такого анализа значительно снижают реальную ценность существующего лабораторного исследования, основанного на представлениях, сложившихся в микробиологии в 1930–1940-х гг. Можно предполагать, что патологический процесс у больной, от которой получен материал для данного исследования, вызван не тем микробом или микробами, которые удалось выделить и идентифицировать стандартными методами. Данные метагеномного анализа указывают также на условность результатов выбора антибиотиков для терапии, поскольку не выделенные и не изученные пока некультивируемые бактерии, находящиеся в патологическом материале, имеют индивидуальную чувствительность к противомикробным препаратам, отличную от таковой у изолированного штамма кишечной палочки.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о более широком распространении смешанных инфекций мочевой системы и указывают на необходимость пересмотра существующих методов лабораторной диагностики и выбора антибиотика.