English
С начала 1990-х гг. исследователи по всему миру пытались реконструировать мочевой пузырь с использованием технологий и методов тканевой инженерии, в том числе клеточных технологий. Однако забор здоровых собственных клеток пациента не всегда возможен из-за фиброзной трансформации тела мочевого пузыря. Таким образом, необходимо продолжать эксперименты, чтобы найти наиболее подходящий источник клеток и тип скаффолда для тканевой инженерии мочевого пузыря. Несмотря на все попытки, положительные результаты были достигнуты не во всех исследованиях из-за возникших морфологических и функциональных проблем, а также проблем биосовместимости. У созданного целиком из синтетических материалов мочевого пузыря полностью отсутствовала способность к сокращению, кроме того, исследователи отметили повышенное образование камней в мочевыводящих путях при использовании данного вида трансплантата. Использование биодеградируемых материалов сопровождалось инфильтрацией фибробластов, рубцеванием и как следствие – уменьшением емкости мочевого пузыря [1].
В настоящее время для восстановления мочевого пузыря хирурги используют различные фрагменты желудочно-кишечного тракта. Эта операция неизбежно приводит к ряду осложнений и часто сильно снижает качество жизни пациента [2, 3]. Повышение интереса к регенеративной медицине стимулирует разработку и внедрение новых клеточных технологий, в особенности методов тканевой инженерии, которые могут быть использованы для создания идеального материала для трансплантата мочевого пузыря [3].
Возможность использования клеточной трансплантации для формирования материала, замещающего стенку мочевого пузыря, открыла новые перспективы. Использование дифференцировочного потенциала прогениторных клеток позволило воссоздать мышечный слой, тем самым сохранив основную функцию мочевого пузыря [1].
Был проведен систематический поиск доклинических и клинических исследований, проведенных вплоть до июня 2016 г., посвященных тканевой инженерии и реконструкции мочевого пузыря согласно методике, приведенной в статье П.В. Глыбочко и соавт. [45].
Для более подробного анализа в данном обзоре были выбраны исследования с использованием матриц, засеянных одним (табл. 1) и двумя типами клеток (табл. 2).
Было продемонстрировано, что клетки уротелия и мышечные клетки могут культивироваться in vitro на матрице из децеллюляризированной стенки мочевого пузыря, таким образом создавая трансплантат стенки [34].
В одном из ранних исследований [5] пласт силикона был хирургически введен в паховую область крыс для образования капсульного мешка. Клетки уротелия культивировали одновременно, суспендировали в фибрине и высевали на вновь сформированную капсулу после удаления силикона. Иммуногистохимический анализ показал формирование многослойного уротелия в месте трансплантации капсульного мешка в опытной группе. Кроме того, смертность животных опытной группы была гораздо ниже, нежели в контрольных, в которых на подложку наносили фибриновый клей (80%-ная смертность) или физраствор (100%-ная смертность).
Использование генномодифицированных клеток – интересный экспериментальный подход в тканевой инженерии мочевого пузыря. В исследовании [16] оценивали эффективность VEGF-генномодифицированных эндотелиальных клеток-предшественников, посеянных на BAM с целью увеличения васкуляризации трансплантата. Согласно протоколу, генетически модифицированные клетки наряду с VEGF экспрессировали и зеленый флуоресцентный белок (GFP). С помощью сканирующей электронной микроскопии и трехцветного окрашивания гистологических срезов по Массону были показаны прикрепление клеток и их пролиферация на поверхности BAM. Данные гистологического исследования свидетельствовали об ускоренной регенерации мочевого пузыря. В опытной группе наблюдалось значительное увеличение плотности микрососудов по сравнению с контрольной группой. Данный результат указывает на то, что генная модификация клеток в сочетании с генной терапией может быть правильным подходом, направленным на увеличение кровоснабжения трансплантата в тканевой инженерии мочевого пузыря.
К одним из современных направлений тканевой инженерии относится технология «cell-sheet» – клеточных листов. Целью исследования [27] было изучить возможности нового подхода на примере клеточных листов из аутологичных гладкомышечных клеток кролика. В данной работе 24 животных были случайным образом разделены на две группы. В экспериментальной группе гладкомышечные клетки, полученные из мышечного слоя мочевого пузыря, и меченые PKH-26 – красным флуоресцентным маркером, высевали на культуральных чашках с переменной адгезией. Непрерывные клеточные пласты снимали с чашки путем снижения температуры, процедуру повторяли до получения тройного слоя клеток. После частичной цистэктомии тканеинженерные конструкции пересаживали в дивертикулы мочевого пузыря. Контрольная группа подверглась частичной цистэктомии с последующим замещением повреждений с помощью жировой клетчатки. По истечении 2, 4 и 12 нед были проведены гистологические и иммуногистохимические исследования: окраска гематоксилином и эозином, трехцветная окраска по Массону, окраска флюоресцентными антителами к кластеру дифференциации 34 (CD34), CD31, CD3, CD68, α-актину гладких мышц (α-SMA). Исследования были проведены для оценки роли введенных клеток в регенерации мочевого пузыря. Через 2 нед после трансплантации клеточного листа гладкомышечные клетки, меченные РКН-26, определялись в мышечном слое стенки мочевого пузыря. По истечении 4 нед 79,1% клеток в мышечном слое поврежденного участка составили РКН-положительные клетки. Толщина мышечного слоя увеличилась в опытной группе в период наблюдения и была сопоставимой с толщиной мышечной стенки нормального мочевого пузыря по истечении 12 нед.
Было проведено лишь одно клиническое исследование [22] с использованием матриц, засеянных одним типом клеток, и оно нуждается в отдельном упоминании. В нем приняли участие дети с нейрогенным мочевым пузырем, связанным с пороком развития позвоночника, требующим проведения цистопластики. Полученные путем биопсии клетки уротелия были высеяны на биодеградируемый скаффолд с целью формирования трансплантата. Введение слинга в шейку мочевого пузыря было единственной разрешенной сопутствующей хирургической процедурой. Первичная оценка была проведена спустя 12 мес по параметрам изменения пузырной емкости, сократимости и безопасности процедуры. Долгосрочные эффекты оценивали спустя 36 мес, однако отличия от результатов первичной оценки не были статистически или клинически значимыми. Побочные эффекты были зафиксированы у всех пациентов, и большинство из них были легко купированы. Введение биодеградируемой матрицы, засеянной аутологичными клетками, не привело к существенному увеличению емкости мочевого пузыря или восстановлению его нормальной сократимости, а серьезные побочные эффекты заставили прекратить дальнейшие исследования.
Большинство экспериментальных исследований с использованием двух типов клеток было основано на выращивании клеток мочевого пузыря на подслизистой тонкой кишки, в котором клетки гладких мышц и уротелия высевали по отдельности и подвергали сокультивированию для получения 3D-структуры. Подобное сокультивирование усиливает инвазию клеток гладких мышц в матрикс. Также показано, что подслизистая тонкого кишечника обеспечивает соответствующую in vitro среду для межклеточных и клеточно-матриксных взаимодействий, которые способствуют организованной модели роста. Результаты позволяют предположить, что небольшой участок кишечной подслизистой может обеспечивать уникальную in vitro среду для начальной индукции роста клеток, что служит преимуществом по сравнению с другими материалами. Тем не менее еще предстоит выяснить, является ли такая среда абсолютно необходимой для функциональной регенерации ткани, так как реципиент может быть в состоянии обеспечить соответствующую среду после того, как тканеинженерная конструкция будет имплантирована.
Целью исследования [42], проведенного в 2008 г., была сравнительная оценка регенерации и восстановления мочевого пузыря после 80%-ной цистэктомии. Цистопластику выполняли с использованием синтетического биополимера, засеянного уротелиальными и гладкомышечными клетками или путем аутотрансплантации нативного мочевого пузыря (реимплантации родного мочевого пузыря) у собак. Оценивали уродинамику и отношение массы пузыря к массе тела в течение в общей сложности 24 мес после цистопластики. В течение 30 дней после имплантации показатели общего анализа крови и анализа мочи возвращались к исходным значениям. Пересаженные трансплантаты сформировали органы со статистически эквивалентными нативным органам уродинамикой и гистологией. На восстановление гистологии мочевого пузыря ушло 3 мес, емкости – 3–6, уродинамики – 12–24 мес. Кроме того, конструкция продемонстрировала способность регенерированного мочевого пузыря реагировать на рост и развитие собаки.
Исследование [43] было проведено на 8 собаках, прошедших процедуру частичной цистэктомии. Шесть собак (экспериментальная группа) подверглись цистопластике с использованием тканеинженерных конструкций, изготовленных из аутологичных уротелиальных и гладкомышечных клеток на матрице из полигликолевой кислоты. Двум биглям (контрольная группа) выполнена цистопластика с использованием бесклеточной матрицы. Мочевой пузырь и внутренние органы были извлечены через 6 мес после операции. Результаты гистологического исследования показали, что имплантаты на основе полимеров, засеянных аутологичными клетками мочевого пузыря, не стали причиной значительной местной или системной токсической реакции.
В работе [39], проведенной в 2006 г., участвовали 7 пациентов в возрасте от 4 до 19 лет с менингоцеле с нарушениями сократимости мочевого пузыря, отобранные в качестве кандидатов на цистопластику. Каждому пациенту была выполнена биопсия стенки мочевого пузыря. Уротелиальные и мышечные клетки выращивали в культуре и высевали на биоразлагаемой матрице, изготовленной из коллагена или композита из коллагена и полигликолевой кислоты. Спустя 7 нед после биопсии тканеинженерные конструкции мочевого пузыря были использованы для цистопластики и имплантированы с/без обертки из сальника. Об успешности трансплантации судили на основании данных уродинамического исследования, цистограммы, УЗИ и биопсии мочевого пузыря, а также общего анализа крови. Оценка проводилась ежемесячно в течение 22–61 мес (в среднем 46 мес) после операции. Наилучшие показатели были достигнуты при использовании композитных конструкций с сальниковой оберткой. Не было отмечено никаких метаболических последствий, мочекаменной болезни, нарушений образования слизи или функции почек. Биопсия мочевого пузыря выявила адекватную тканевую архитектуру и фенотип. Таким образом, тканеинженерные конструкции, созданные с помощью аутологичных клеток, посеянных на каркасах из коллагена и полигликолевой кислоты и обернутые в сальник, могут быть использованы пациентами, нуждающимися в цистопластике.
Большинство исследований с использованием тканеинженерных клеточных конструкций проводилось на небольших моделях животных, в основном на крысах. Это важная причина, почему, несмотря на большое разнообразие методов тканевой инженерии, предлагаемых для увеличения мочевого пузыря, ни один из них не вошел в клиническую практику. Безопасность и эффективность, пожалуй, ни одного типа конструкций не доказаны настолько, чтобы перейти к клиническим исследованиям. В основу доказательной базы должны быть положены данные исследований, проведенных на большой животной модели, мочевыделительная система которой по гистологии, структуре и физиологии похожа на таковую у человека. Результаты цистопластики мочевого пузыря крысы практически невозможно экстраполировать на человека; кроме того, трудно предсказать возможные побочные эффекты.
С целью дальнейшего развития тканевой инженерии мочевого пузыря целесообразно как можно шире использовать современные возможности клеточных технологий – генную модификацию клеток, формирование клеточных пластов in vitro, 3D-моделирование тканеинженерных конструкций.
