Урология » Видовая струк- тура и молекулярно-генетическая характеристика антибио- тикорезистентных штаммов грамотрицательных микроорганизмов, выделенных от пациентов урологического отделения

Видовая струк- тура и молекулярно-генетическая характеристика антибио- тикорезистентных штаммов грамотрицательных микроорганизмов, выделенных от пациентов урологического отделения

DOI: https://dx.doi.org/10.18565/urology.2018.1.77-83

Б.У. Шалекенов, А.Л. Бисекенова, Б.А. Рамазанова, Д.А. Адамбеков, С.Б. Шалекенов
1 Казахский медицинский университет непрерывного образования, Алматы, Казахстан; 2 Казахский национальный медицинский университет им. С. Д. Асфендиярова, Алматы, Республика Казахстан; 3 Кыргызская государственная медицинская академия им. И. К. Ахунбаева, Бишкек, Кыргызская Республика

Цель: провести анализ структуры и молекулярных механизмов антибиотикорезистентности грамотрицательных бактерий – возбудителей инфекций мочевыводящих путей (ИМП) у взрослых пациентов Алматы.
Материалы и методы. Изучены этиологическая структура и антибиотикочувствительность клинически значимых изолятов бактерий и грибов (≥ 103), выделенных из мочи пациентов отделения урологии ЦГКБ № 12 Алматы. Продукцию β-лактамаз расширенного спектра действия (БЛРС) у антибиотикорезистентных штаммов определяли фенотипическим методом двойных дисков. Детекцию генов класса А для культур с подтвержденным БЛРС-фенотипом (TEM1, CTX-M1, SHV, OXA), генов карбапенемаз класса B металло-β-лактамаз (VIM-2) проводили методом ПЦР.
Результаты. Среди изолятов, полученных от пациентов, доля представителей семейства Enterobacteriaceae в этиологической структуре возбудителей ИМП составила 44,8%, в том числе E. coli была возбудителем в 31% случаев, K. pneumoniae – в 4,6%. Наибольшей активностью по отношению ко всем видам энтеробактерий обладали карбапенемы (96,3–100%). В отношении E. coli высокую активность проявляли нитрофурантоин (96,3%), амикацин (92,6%) и цефокситин (81,5%). Высокая частота резистентности к цефалоспоринам III–IV поколений E. coli (44,4%), K. pneumoniae (50%) была обусловлена продукцией БЛРС CTX-M1- и OXA-типов. Доля неферментирующих грамотрицательных бактерий в этиологической структуре возбудителей ИМП составила 3,5%. Среди них зарегистрирован штамм, продуцирующий металло-β-лактамазу (VIM-2), характеризующийся абсолютной резистентностью к антибиотикам всех классов, включая карбапенемы.
Заключение. Полученные данные по профилям чувствительности и молекулярно-генетическим механизмам резистентности грамотрицательных уропатогенов уникальны для региона (Алматы), позволяют разработать тактику рациональной антибиотикотерапии. Своевременная микробиологическая диагностика и строгое соблюдение мер инфекционного контроля в конкретном стационаре – единственный путь сдерживания распространения БЛРС, МБЛ.

Ключевые слова: инфекции мочевыводящих путей, грамотрицательные микроорганизмы, Enterobacteriaceae, антибиотикорезистентность, β-лактамазы расширенного спектра, металло-β-лактамазы

Введение. Поиск новых подходов к лечению инфекций в урологии, систематизации и стандартизации схем лечения в клинической практике диктует необходимость постоянного мониторинга эпидемиологической ситуации, знания структуры возбудителей, изучения уровня резистентности микроорганизмов по регионам.

Известно, что в этиологической структуре возбудителей внутрибольничных и внебольничных инфекций мочевыводящих путей (ИМП) ведущая роль принадлежит грамотрицательным микроорганизмам. По данным многочисленных исследований, примерно в 50–90% случаев этиологическим фактором выступает E. coli [1–6]. При этом отмечается некоторое увеличение (по сравнению с неосложненными) доли K. pneumoniae (10,3%) и P. aeruginosa (4,3%) в структуре возбудителей осложненных ИМП [7].

В настоящее время одной из наиболее клинически значимых проблем химиотерапии является резистентность возбудителей к современным цефалоспоринам и карбапенемам вследствие эпидемического распространения штаммов, продуцирующих β-лактамазы расширенного спектра действия (БЛРС), металло-β-лактамазы класса B (МБЛ) [8–16]. Также при планировании политики антимикробной терапии целесообразно опираться на локальные (региональные) данные, полученные в данной стране или в ее регионе.

Цель: провести анализ структуры и молекулярных механизмов антибиотикорезистентности грамотрицательных бактерий – возбудителей ИМП у взрослых пациентов Алматы.

Материалы и методы. В исследование было включено 87 клинически значимых изолятов (≥103 КОЕ/мл) бактерий и грибов, собранных от пациентов с ИМП отделения урологии ГКБ № 12 Алматы в рамках внутривузовского научного проекта «Мониторинг резистентности возбудителей внебольничных и нозокомиальных инфекций к антимикробным препаратам и изучение его молекулярных механизмов».

Микробиологическое выделение из мочи и первичная идентификация бактериальных изолятов проведены в лаборатории кафедры микробиологии КазНМУ им. С. Д. Асфендиярова. Окончательную видовую идентификацию и определение их чувствительности к антимикробным препаратам осуществили в НКДЛ НИИ им. Атчабарова. Все исследованные изоляты были идентифицированы до вида, была определена их антибиотикочувствительность на бактериологическом автоматизированном анализаторе VITEK-2 Compact, дополнительно использован классический дискодиффузионный метод определения антибиотикочувствительности на агаре Мюллера–Хинтона, согласно рекомендациям EUCAST [17].

Продукцию БЛРС определяли с помощью фенотипического метода двойных дисков по наличию расширенной зоны подавления роста между дисками с цефтазидимом (CAZ, 30 мкг), цефепимом (CPM, 30 мкг) и диском, содержащим комбинацию амоксициллина с клавулановой кислотой (AMC 20/10 мкг) [18]. Для контроля качества определения чувствительности использованы штаммы E. coli ATCC 25922, K. pneumoniae ATCC 700603 (ESBL+).

Детекцию наиболее распространенных и клинически значимых генов класса А (TEM1, СTX-M1, SHV, OXA) для культур с подтвержденным ESBL-фенотипом проводили методом ПЦР [19]. Геномную и плазмидную ДНК грамотрицательных бактерий выделяли по стандартной методике с помощью набора Easy Pure Bacteria Genomic DNA Kit (выделение геномной ДНК) и Easy Pure Plasmid MiniPrep Kit (выделение плазмидной ДНК) («TransGenBiotech», Китай). Использовали по 5 мл 18–20-часовой культуры бактерий.

Использованные праймеры для проведения ПЦР на 4 пары генов БЛРС (TEM1, CTX-M1, SHV, OXA) приведены в табл. 1.

Для ПЦР использовали по 10 пмоль каждых праймеров и 20 нг геномной и плазмидной ДНК бактерий, т.е. проводили 2 реакции на 1 образец. Применяли готовый мастер миксPlatinum® PCRSuperMix (LifeTechnologies, CAUSA), объем реакции составил 25 мкл, амплификацию осуществляли с использованием термоциклера BioRadIQ5 (Bio-RadLaboratories, Inc., CAUSA) по стандартному протоколу. Последующую детекцию генов проводили на 1%-ном агарозном геле с добавлением этидиум бромида. По образованию продукта амплификации делали заключение о наличии или отсутствии гена, характеризующегося определенной длиной.

Детекцию генов карбапенемаз класса B металло-β-лактамаз (VIM-2) у выделенных и идентифицированных бактериальных изолятов P. aeruginosa провели методом ПЦР в режиме реального времени с использованием коммерческих наборов «АмплиСенс®. MDRAcinetobacter-OXA-FL» и «АмплиСенс®. MDRMBL-FL» (ФБУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора, Россия) и системы Rotor-Gene 6000 («CorbettResearch», Австралия) в НИИ антимикробной химиотерапии Смоленска в рамках участия в многоцентровом проекте APEх.

Результаты. В этиологической структуре ИМП в отделении урологии ГКБ № 12 Алматы ведущую роль играли представители семейства Enterobacteriaceae – 44,8%, при этом E. coli оказались возбудителем для 31% пациентов. Доля изолятов неферментирующих грамотрицательных бактерий (НФГОБ) составила 3,5% (рис. 1).

Распределение всех видов выделенных изолятов в этиологической структуре ИМП представлено в табл. 2, из них наибольшее количество (27 [31%]) изолятов было представлено E. coli. Значительно реже выделяли K. pneumoniaе (4,6%), E. cloacae (2,3%). Изолятов НФГОБ было выделено 3, из них 2 штамма P. aeruginosa. Среди грамположительных уропатогенов наиболее распространенными были Staphylococcus haemolyticus (11,5%), Enterococcus faecalis (10,4%), Staphylococcus aureus (8,1%).

Результаты оценки чувствительности основных изолятов Enterobacteriaceae и НФГОБ представлены в табл. 3.

Как видно из результатов исследования, имеется высокая доля штаммов E. coli, резистентных к ампициллину (88,9%), пиперациллину (81,5%), а также к триметоприму/сульфаметоксазолу (70,4%). Зарегистрирован относительно высокий уровень резистентности к фторхинолонам ципрофлоксацину (48,2%) и левофлоксацину (48,2%). К цефалоспоринам III–IV поколений: к цефтазидиму были резистентны 48,2%, условно резистентны – 25,9%; к цефтриаксону – 70,4% и цефепиму – 14,8%, условно резистентны – 48,2% штаммов. К аминогликозидам гентамицину и тобрамицину резистентность проявляли 29,6% штаммов E. coli (рис. 2). Наиболее активными препаратами в отношении E. coli были карбапенемы и амикацин (96,3 и 92,6% чувствительных штаммов соответственно).

При ПЦР-детекции наличие генов наиболее распространенных групп β-лактамаз (TEM, CTX, OXA) подтверждено у 18 из 27 штаммов уропатогенной E. coli (66,7%).

У 17 штаммов были зарегистрированы гены TEM1 (продукция β-лактамаз широкого спектра действия), из них 7 изолятов несли одновременно гены двух групп β-лактамаз TEM1+CTX-M1; 3 штамма одновременно – комбинацию генов TEM1+CTX-M1+ OXA; 1 штамм – TEM1+OXA. Изолированно ген CTX-M1 зарегистрирован у 1 штамма E. coli (рис. 3).

Известно, что CTX-M1, OXA генетически связаны с β-лактамазами широкого спектра и отличаются от TEM1 единичными аминокислотными заменами, расширяющими спектр ферментативной активности. Таким образом, продукция БЛРС, которые разрушают все β-лактамные антибиотики, за исключением цефамицинов (цефокситин) и карбапенемов, как основной механизм устойчивости к оксииминоцефалоспоринам была выявлена у 12 (44,4%) штаммов E. coli (по фенотипическим признакам и генетической детекции – blaTEM1+CTX-M1; blaTEM1+CTX-M1+OXA; blaTEM1+OXA; blaCTX-M1).

Выделенные в ходе исследования штаммы K. pneumoniae в 4,6% случаев оказались возбудителями ИМП и отличались абсолютной резистентностью к ампициллину (100%), пиперациллину (100%). Все штаммы K. pneumoniae были чувствительными к карбапенемам. Ко всем остальным группам антибиотиков 50% штаммов проявляли устойчивость (рис. 4).

Резистентные к цефалоспоринам III–IV поколений штаммы K. pneumoniae (50%) были продуцентами blaOXA. Резюмируя эти данные, можно сказать, что наиболее часто уропатогенные E. coli в данном стационаре продуцируют β-лактамазы широкого спектра действия TEM-1-типа и ее комбинации с БЛРС CTX-M1, уропатогенные K. pneumoniae – БЛРС OXA-типа.

Два изолята Enterobacter cloacae, выделенные у больных ИМП, проявляли чувствительность к мерапенему и имипенему (100%), тобрамицину (50%) и триметоприму/сульфаметоксазолу (50%). К пиперациллину, амикацину, фторхинолонам, гентамицину, эртапенему, цефалоспоринам III–IV поколений, цефокситину регистрировалась абсолютная резистентность (100%).

Из исследованных генов при ПЦР-детекции у одного из штаммов E. cloacae обнаружены гены TEM1. Резистентность к цефалоспоринам, вероятно, обусловлена продукцией хромосомных β-лактамаз класса С, признаком чего является выявленная у данных штаммов устойчивость к цефокситину.

Неферментирующие грамотрицательные бактерии в этиологической структуре ИМП занимали 3,45%. Выделенные в ходе исследования 2 изолята P. aeruginosa были абсолютно резистентными ко всем исследованным антибиотикам, кроме имипенема в 1 случае.

Нечувствительный к карбапенемам, включая и имипенем, нозокомиальный штамм P. aeruginosa № 349, выделенный от пациента Д. 1963 г. рождения с диагнозом «мочекаменная болезнь, острый пиелонефрит справа; пузырно-мочеточниковый рефлюкс», проявил ассоциированную устойчивость к антибиотикам других классов: пиперациллину, фторхинолонам, аминогликозидам и цефалоспоринам. При ПЦР-детекции выявлен ген VIM-2, кодирующий выработку карбапенемаз молекулярного класса В МБЛ.

Выводы

По данным нашего исследования, основное место в этиологической структуре возбудителей ИМП занимают представители семейства Enterobacteriaceae (44,8%), к основным возбудителям относятся E. coli (31%) и K. pneumoniae (4,6%).
Среди изученных антибактериальных препаратов карбапенемы обладают наибольшей активностью по отношению ко всем видам энтеробактерий (96,3–100%). В отношении E. coli высокую активность проявляли нитрофурантоин (96,3%), амикацин (92,6%) и цефокситин (81,5%).
Высокая частота резистентности к современным цефалоспоринам, обусловленная распространением БЛРС типов CTX-M1 и OXA, у E. coli в 44,4% случаев, у K. pneumoniae в 50%, исключает возможность их эмпирического применения для лечения ИМП, вызванных энтеробактериями.
Высокая частота сочетанной устойчивости выделенных штаммов E. coli, K. pneumoniae к традиционно используемым не-β-лактамным антибиотикам: фторхинолонам (ципрофлоксацин, левофлоксацин) – 48,2–50%, к триметоприму/сульфаметоксазолу (50–70,4%) также не позволяет рекомендовать их широкое применение, за исключением случаев подтвержденной чувствительности.
Регистрация нозокомиального МБЛ VIM-2 продуцирующего штамма P. aeruginosa в отделении урологии ГКБ № 12 Алматы, обладающего ассоциированной резистентностью к антибиотикам всех классов, за исключением полимиксинов, ограничивает возможности терапии инфекций, вызванных такими штаммами. В этой ситуации своевременная микробиологическая диагностика и строгое соблюдение мер инфекционного контроля в стационаре – единственный путь сдерживания распространения МБЛ.

Литература

1. Palagin I.S., Sukhorukova M.V., Dekhnich A.V., Eidel’shtein M.V., Shevelev A.N., Grinev A.V., Perepanova T.S., Kozlov R.S., DARMIS study group. The current state of antibiotic resistance of causative agents of community-acquired infections of the urinary tract in Russia: the results of the DARMIS study (2010–2011). Klinicheskaya mikrobiologiya antimikrobnaya khimioterapiya. 2012;14(4):280–301. Russian (Палагин И.С., Сухорукова М. В., Дехнич А.В., Эйдельштейн М. В., Шевелев А. Н., Гринев А.В., Перепанова Т.С., Козлов Р.С., исследовательская группа «ДАРМИС». Современное состояние антибиотикорезистентности возбудителей внебольничных инфекций мочевых путей в России: результаты исследования «ДАРМИС» (2010–2011). Клиническая микробиология антимикробная химиотерапия. 2012;14(4):280–301).

2. Hooton T.M. Uncomplicated urinary tract infection. New Engl J Med. 2012;366:1028–1037.

3. Kahlmeter G., ECO.SENS. An international survey on the antimicrobial susceptibility of pathogens from uncomplicated urinary tract infections: the ECO.SENS Project. J Antimicrob Chemother. 2003;51:69–76.

4. Nicole L. Epidemiology of urinary tract infections. Infect Med. 2001;18:153–162.

5. Foxman B. Epidemiology of urinary tract infetions: incidence, morbility and economic cost. Am J Med. 2002;113:5–13.

6. Kosyakova K.G., Kameneva O.A., Morozova S.E. The etiological structure and antibiotic resistance of pathogens of community-acquired infections of the urinary system. Klinicheskaya mikrobiologiya antimikrobnaya khimioterapiya. 2015;17(2)1:33. Russian (Косякова К.Г., Каменева О.А., Морозова С.Е. Этиологическая структура и антибиотикорезистентность возбудителей внебольничных инфекций мочевой системы. Клиническая микробиология антимикробная химиотерапия. 2015;17(2)1:33).

7. Palagin I.S., Sukhorukova M.V., Dekhnich A.V., Eidel’shtein M.V., Grinev A.V., Perepanova T.S., Kozlov R.S., DARMIS study group. Complicated out-of-hospital infections of the urinary tract in adult patients in Russia. Klinicheskaya mikrobiologiya antimikrobnaya khimioterapiya. 2014;16(1):39–56. Russian (Палагин И.С., Сухорукова М.В., Дехнич А.В., Эйдельштейн М.В., Гринев А.В., Перепанова Т.С., Козлов Р.С., исследовательская группа «ДАРМИС». Осложненные внебольничные инфекции мочевых путей у взрослых пациентов в России. Клиническая микробиология антимикробная химиотерапия. 2014;16(1):39–56).

8. Sidorenko S.V., Berezin A.G., Ivanov D.V. Molecular mechanisms of resistance of gram-negative bacteria of the Enterobacteriaceae family to cephalosporin antibiotics. Antibiotiki i khimioterapiya. 2011;49(3):6–16. Russian (Сидоренко С.В., Березин А.Г., Иванов Д.В. Молекулярные механизмы устойчивости грамотрицательных бактерий семейства Enterobacteriaceae к цефалоспориновым антибиотикам. Антибиотики и химиотерапия. 2011;49(3):6–16).

9. Il’ina V.N., Subbotovskaya A.I., Kozyreva V.S., Sergeevichev D.S., Shilova A.N. Characteristics of Enterobacteriaceae strains producing CTXM type ESBL, isolated in a cardiac surgery hospital. Klinicheskaya mikrobiologiya antimikrobnaya khimioterapiya. 2013; 15(4):309–314. Russian (Ильина В.Н., Субботовская А.И., Козырева В.С., Сергеевичев Д.С., Шилова А.Н. Характеристика штаммов Enterobacteriaceae, продуцирующих БЛРС CTX-M типа, выделенных в кардиохирургическом стационаре. Клиническая микробиология антимикробная химиотерапия. 2013; 15(4):309–314).

10. Breidenstein E.B., delaFuente-Nunez C., Hancock R.E. Pseudomonas aeruginosa: all roads lead to resistance. Trends Microbiol. 2011;19(8):419–426.

11. Eidel’shtein M.V., Skleenova E.Yu., Shevchenko O.V. et al. The prevalence and molecular epidemiology of Gram-negative bacteria producing metal-beta-lactamase in Russia, Belarus and Kazakhstan. Klinicheskaya mikrobiologiya antimikrobnaya khimioterapiya.2012;14(2):132–152. Russian (Эйдельштейн М.В., Склеенова Е.Ю., Шевченко О.В. и др. Распространенность и молекулярная эпидемиология грамотрицательных бактерий, продуцирующих металло-бета-лактамазы, в России, Беларуси и Казахстане. Клиническая микробиология антимикробная химиотерапия.2012;14(2):132–152).

12. Pfeifer Y., Cullik A., Witte W. Resistance to cephalosporins and carbapenems in Gram-negative bacterial pathogens. Int J Med Microbiol. 2010;300(6):371–379.

13. Eidel’shtein M.V., Sukhorukova M.V., Skleenova E.Yu., Ivanchik N.V. et al. Antibiotic resistance of nosocomial strains of Pseudomonas aeruginosa in Russian hospitals: results of a multicentre epidemiological study MARATHON 2013–2014. Klinicheskaya mikrobiologiya antimikrobnaya khimioterapiya. 2017; 19(1): 37–41. Russian (Эйдельштейн М.В., Сухорукова М.В., Склеенова Е.Ю., Иванчик Н.В. и др. Антибиотикорезистентность нозокомиальных штаммов Pseudomonas aeruginosa в стационарах России: результаты многоцентрового эпидемиологического исследования «МАРАФОН» 2013–2014. Клиническая микробиология антимикробная химиотерапия. 2017; 19(1): 37–41).

14. Sukhorukova M.V., Eidel’shtein M. V., Skleenova E.Yu., Ivanchik N.V. et al. Antibiotic resistance of nosocomial strains of Enterobacteriaceae in Russian hospitals: results of a multicentre epidemiological study MARATHON 2013–2014. Klinicheskaya mikrobiologiya antimikrobnaya khimioterapiya. 2017; 19(1):49–56. Russian (Сухорукова М.В., Эйдельштейн М. В., Склеенова Е.Ю., Иванчик Н.В. и др. Антибиотикорезистентность нозокомиальных штаммов Enterobacteriaceae в стационарах России: результаты многоцентрового эпидемиологического исследования «МАРАФОН» 2013–2014. Клиническая микробиология антимикробная химиотерапия. 2017; 19(1):49–56).

15. Ghafourian S. et al. Incidence of extended-spectrum beta-lactamase-producing Klebsiellapneumniae in patients with urinary tract infection. Sao Paulo Med. J. 2012;130(1):37–43.

16. Eidel’shtein M.V., Skleenova E.Yu., Shevchenko O.V., Tapal’skii D.V., Azizov I.S., Dsouza D.V., Timokhova A.V., Sukhorukova M.V., Kozyreva V.K., Safronova E.V., Astakhova M.V., Karpov I.A., Shamaeva S.Kh., Abramova N.V., Gordinskaya N.A., Kozlov R.S. Prevalence and molecular epidemiology of gram-negative bacteria producing metal-beta-lactamases in Russia, Belarus and Kazakhstan. Klinicheskaya mikrobiologiya antimikrobnaya khimioterapiya. 2012;14(2):132–152. Russian (Эйдельштейн М.В., Склеенова Е.Ю., Шевченко О.В., Тапальский Д.В., Азизов И.С., Дсоуза Д.В., Тимохова А.В., Сухорукова М.В., Козырева В.К., Сафронова Е.В., Астахова М.В., Карпов И.А., Шамаева С.Х., Абрамова Н.В., Гординская Н.А., Козлов Р.С. Распространенность и молекулярная эпидемиология грамотрицательных бактерий, продуцирующих метало-бета-лактамазы, в России, Беларуси и Казахстане. Клиническая микробиология антимикробная химиотерапия. 2012;14(2):132–152).

17. The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Breakpoint Tables for interpretation of MICs and zone diameters. Version 4.0, 2014 (http://www.eucast.org).

18. Eidel’shtein M.V. Detection of extended-spectrum beta-lactamases in Gram-negative bacteria using phenotypic methods. Klinicheskaya mikrobiologiya antimikrobnaya khimioterapiya. 2001;3(2):183–189. Russian (Эйдельштейн М.В. Выявление бета-лактамаз расширенного спектра у грамотрицательных бактерий с помощью фенотипических методов. Клиническая микробиология антимикробная химиотерапия. 2001;3(2):183–189).

19. Monstein H.J., Ostholm-Balkhed A., Nilsson M.V., Nilsson M., Dornbusch K., Nilsson L.E. Multiplex PCR amplification assay for the detection of blaSHV, blaTEM and blaCTX-M genes in Enterobacteriaceae. APMIS 2007;115:1400–1408.

Об авторах / Для корреспонденции

А в т о р д л я с в я з и: А. Л. Бисекенова – к.м.н., доцент кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии КазНМУ им. С. Д. Асфендиярова, Алматы, Республика Казахстан; e-mail: bissekenova_akma@mail.ru

К содержанию номера