Бактериальная колонизация
В 2007–2011 гг. исследовательской группой во главе с K. Melican [1–4] были проведены оригинальные прижизненные исследования на животных моделях острого пиелонефрита (ОП). Интравитальная визуализация, основанная на двухфотонной микроскопии, позволила изучить патофизиологию заболевания на клеточном уровне у живых животных с возможностью в режиме реального времени наблюдать за взаимодействием сосудистой, иммунной, нервной систем организма хозяина.
Непосредственно в просвет почечного канальца были введены штаммы уропатогенной кишечной палочки (УПКП). Исследователи провели пространственный и временной динамический анализ реакций уропатогена и хозяина.
Поначалу лишь немногие из УПКП прикреплялись к эпителию канальца, противодействуя потоку клубочкового фильтрата, смывающего их значительные количества. Однако адгезировавшиеся бактерии дали старт колонизации канальца [2, 5, 6], затем начинался процесс взаимодействия бактерий и хозяина, о котором будет сказано далее. А здесь важно обсудить, благодаря каким качествам УПКП осуществляют адгезию к эпителиальным клеткам канальца. Понятно, что для реализации этого процесса УПКП должны обладать широким спектром «инструментов», к таковым относятся органеллы Р, тип 1, FYC, S-фимбрии и адгезины Afa/Dr [4, 5, 7].
Восемьдесят процентов штаммов УПКП имеют P-фимбрии, более характерные для штаммов, вызывающих пиелонефрит, чем цистит. Причем присутствие Р-фимбрий увеличивает тяжесть инфекции, т.е. экспрессия Р-фимбрий строго взаимосвязана с вирулентностью. Вместе с тем определено, что, несмотря на присутствие Р-фимбрий у УПКП воспаление к концу первых суток инфицирования проявляется отеком с множеством нейтрофилов, которые поглощают абсолютное большинство бактерий [1, 8].
Кроме Р-фимбрий УПКП, вызывающие пиелонефрит, способны экспрессировать фимбрии типа 1. Оказалось, что фимбрии Р и типа 1, действуя синергично, успешно противостоят гидродинамическому давлению в просвете извитого проксимального канальца. Таким образом, Р-фимбрии непосредственно прикрепляют УПКП к эпителию канальца, а фимбрии типа 1 необходимы бактериям для колонизации ближе к центру просвета, где УПКП испытывают наибольшее давление со стороны фильтрата первичной мочи. В связи с этим фимбрии типа 1 играют ключевую роль в процессе межбактериальной адгезии [1]. Данное качество особо проявляется при формировании биопленок и делает УПКП устойчивыми к любым силам гидродинамического потока, способствует колонизации перфузионной среды и позволяет им не вымываться из системы. Активность генов, контролирующих экспрессию фимбрий, характеризуется высокой гибкостью приспособления к изменяющейся среде [9, 10], что позволяет УПКП тонко манипулировать адгезивной активностью в процессе колонизации мочевого тракта.
В целом большинство штаммов УПКП принадлежат к узкому ряду специфических серогрупп: О, К, Н и в составе своих хромосом имеют участки, называемые «островками патогенности», которые содержат определенные гены вирулентности [11]. Именно факторы генов вирулентности бактерий ответственны за способность инфицировать интактные мочевыводящие пути. К настоящему времени известно более 50 различных факторов генов вирулентности [12]. Одни из них ответственны за процессы адгезии, другие – за цитотоксичность, обмен железа необходимого для жизнедеятельности, роста бактерий, инвазивность, способность создавать биофильмы, продуцировать специфические уропатогенные белки и т.д. [13]. Как правило, бактерии, вызывающие ОП, обладают не одним, а несколькими или даже множеством генов вирулентности [14], причем многие из них являются полиморфными вследствие мутаций и делеций [15–18]. Рецидивирующие инфекции мочевыводящих путей (ИМП) воспроизводятся штаммами бактерий с более высокими суммарными показателями факторов генов вирулентности. Таким образом, факторы вирулентности бактерий предопределяются их генетическими характеристиками, которые влияют на скорость развития поражения тканей хозяина и их тяжесть [19].
Бактериальные токсины
Бактериальные токсины, продуцируемые бактериями, также служат фактором их вирулентности. Они вызывают прямое повреждение клеток, разрывая покровные барьеры, и способствуют дальнейшей инвазии в подлежащие ткани [20, 21]. Высокие концентрации токсинов обладают цитолитическим действием на различные клетки: эпителиальные, эритроциты, лейкоциты полиморфно-ядерные и гранулоциты, лимфоциты и т.д. [22, 23]. А низкие концентрации токсинов вызывают провоспалительные реакции в эпителиальных клетках почек [24–27]. Сама по себе колонизация бактерий в канальцах не связана напрямую с их вирулентностью. Однако если микроорганизмы обладают низкой экспрессией факторов вирулентности, то ответная реакция хозяина развивается медленнее, т.е. данные таксоны бактерий генерируют более слабые провоспалительные сигналы. Вместе с тем характер воспалительного ответа и его степень к концу 1-х суток от момента заражения достигают конечных точек.
Среди токсинов наиболее изучен α-гемолизин, являющийся липопротеином, проникающим сквозь клеточную мембрану [4]. Далеко не все E. coli его продуцируют, но он считается одним из важнейших факторов вирулентности, способным лизировать эритроциты [4, 5]. Другой такой липополисахарид представляет собой эндотоксин, выделяемый грамнегативными бактериями. Совместно с липидом А влияет на экспрессию генов в поражаемых клетках, индуцируя полиморфизм однонуклеотидных последовательностей промотера TLR4 и рецептора CXCR1, что снижает экспрессию цитокинов, тем самым отвечая за токсические эффекты и врожденный иммунный ответ [13, 28, 29].
Еще один фактор токсичности связан с метаболическими свойствами некоторых штаммов E. coli и P. mirabilis – их способностью экспрессировать уреазу, которая расщепляет мочевину мочи до аммиака, тем самым повышая pH мочи [13]. Аммиак токсичен по отношению к почечному эпителию, кроме того, щелочная реакция мочи способствует формированию струвитных камней, способных блокировать естественный ток мочи в нефронах.
Реакция хозяина
Бесспорно, возникает вопрос: как же организм хозяина узнает, что бактериальный патоген начинает проявлять свои агрессивные свойства? В настоящее время установлено, что первые реакции хозяина на патоген реализуются посредством врожденного иммунного ответа. И в этой реакции важную роль играют Toll-подобные рецепторы (ТПР), именно они предупреждают хозяина о патогенном микроорганизме путем обнаружения его молекулярных структур (паттернов). Слияние ТПР с молекулярными паттернами патогена активирует в ТПР сигналы, с участием фактора транскрипции IRF3 запускающие типичный провоспалительный ответ [30]. В мочевом тракте доказано наличие ряда ТПР: ТПР4, ТПР5, ТПР11. Экспрессия ТПР4 первоначально осуществляется клетками уротелия дистальных канальцев в их апикальной части [31]. Однако по мере прогрессирования воспаления вплоть до сепсиса экспрессия ТПР4 определяется во всех сегментах почки, а это означает, что в развитии воспаления ТПР несут важную регулирующую функцию в защите хозяина от инфекционного агента [31, 32]. Сигналы от ТПР индуцируют выработку цитокинов, которые, управляя иммунным ответом, инициируют экстравазацию воспалительных клеток — полиморфно-ядерных нейтрофилов и макрофагов, а также их трансэпителиальную миграцию в очаг инфицированной ткани [33, 34]. Ведущую роль в процессах экстравазации и миграции нейтрофилов играют IL-6, -8 и соответствующий рецептор CXCR1 [11, 13, 35, 36]. Уровень цитокинов в моче отражает степень поражения почек. Концентрация IL-8 коррелирует с количеством лейкоцитов в моче [37, 38].
Нейтрофилы в очаге повреждения появляются уже через 4 ч после инфицирования, однако скорость их накопления относительно невелика: через 8 ч количество нейтрофилов составляет 20–40% от всего клеточного состава в экссудате. Доминировать нейтрофилы в экссудате начинают еще через несколько часов [3]. Важнейшая функция нейтрофилов – бактериальный клиренс посредством фагоцитоза, однако с ними связано и тяжелое повреждение тканей. Известно, что нейтрофильные гранулы содержат антимикробные пептиды, протеолитические ферменты, которые могут в острой или перманентной форме повреждать клеточные структуры и нарушать их функции, а также межклеточный матрикс [35]. Ранее было показано, что при подавлении воспаления уменьшается степень повреждения тубулярного уротелия, но при этом возрастает пул бактериальных клеток [39, 40].
Кроме того, бактерии не только сами непосредственно повреждают ткани, но и активируют иммунный ответ.
В частности, гранулоциты вызывают обширные дегенеративные изменения в эпителии почечных канальцев: отек митохондрий, расширение эндоплазматической сети, образование вакуолей в цитоплазме [13].
Помимо описанных механизмов реакции хозяина на инфекционное вторжение существует и хорошо изученный воспалительный ответ, непосредственно связанный с функцией уротелия различных частей нефрона. Речь идет о том, что непосредственно сам уротелий вырабатывает антиадгезивные и антимикробные пептиды и белки, которые обладают прямым антимикробным действием на бактериальные патогены, связываясь с фимбриями и препятствуя адгезии, а также опосредованно влияют на факторы врожденного и приобретенного иммунитета [36, 41]. Наиболее изученный из них белок Tamm-Horsfall (БТХ), вырабатываемый уротелием в петле Генле [42, 43]. Он участвует в синтезе цитокинов, стимуляции гранулоцитов, созревании дендритных клеток. В эпителии канальцев нефрона синтезируются и другие антимикробные пептиды, такие как β-дефензины, кателицидины, которые, как и БТХ, обладают двойным эффектом: прямым – на инвазивные бактерии и косвенным, направленным на усиление врожденного и адаптивного иммунного ответа, тем самым оказывая влияние на рекрутирование иммунных клеток, ангиогенез, заживление ран [44, 45].
Повреждение почек связано и с развитием оксидативного стресса, проявляющегося снижением в тканях почки супероксиддисмутазы. Глутатион — ключевой компонент антиоксидантной защиты, предохраняющий клетки от активных форм кислорода, его уровень снижается в течение первых 7 сут. развития ОП в эксперименте на крысах. Перекисное окисление липидов, являющееся одним из основных механизмов повреждения тканей, усиливается к 7-му дню развития воспаления [33].
Нарушение покровной интеграции
Изучение на мышах целостности покровного слоя лоханки и почечного сосочка показало развитие в нем эрозий и изъязвлений, появление субмукозных гнезд воспалительных клеток и расширенных перитубулярных капилляров, наличие в подлежащем интерстиции крупных инфильтратов из мононуклеарных клеток и отложение в подслизистой коллагена [46].
Каким же образом бактериальная инвазия в почечный каналец отражается на стенке самого канальца? Уже через 4 ч после инфицирования происходит ряд последовательных процессов в канальцевом эпителии и межуточной ткани. Эти процессы приводят к разрушению цитоплазменного скелета в тубулярных эпителиальных клетках, отслоению эпителиального слоя от базальной мембраны [3, 47], потере межклеточной адгезии, нарушению адгезии между клетками и межклеточным матриксом. По сути дела, наблюдается деструкция тубулярной целостности [48–50], что приводит к потере эпителием барьерной функции.
Описанные события имеют еще один механизм, который реализуется в тканях кнаружи от стенки канальца. Бактериальная инвазия активирует сигнальные пути, вызывающие локальную ишемию и повышенную проницаемость перитубулярных артериол и капилляров, а также локальную утечку из них, что также повреждает эпителиальный мембранозный барьер. Важно отметить, что нарушение мембранного барьера происходит только в инфицированных нефронах и не затрагивает интактные.
В то же время на этапе повреждения нефрона прорыва бактерий в кровоток не происходит, так как в качестве защиты выступает перитубулярно расположенный слой интактной соединительной ткани [47]. Таким образом, бактерии остаются внутри канальца и организм хозяина получает время для развития адекватного ответа. Однако если барьер все же прорывается, к этому месту устремляются нейтрофилы и мононуклеары, чтобы «спасти» ситуацию [3, 46]. Совершенно ясно, что канальцы служат резервуаром для бактерий, превращаясь в очаг их персистенции. УПКП образуют биопленки внутри лейкоцитов, собравшихся в просвете канальцев и собирательных протоков, что и служит потенциальной нишей для выживания в мозговом веществе почки [46]. Образование биопленки может способствовать развитию антибиотикоустойчивости УПКП и формированию резервуаров для реинфекции в почечной паренхиме.
Повреждение эпителиального барьера приводит к распространению бактериального воспаления периваскулярно и перитубулярно в интерстиций вплоть до наружных слоев коркового вещества, что сопровождается формированием внутримозговых и кортикальных абсцессов. В 20% случаев кортикальные повреждения имеют треугольную форму, что характерно для воспалительного поражения всех нефронов, впадающих в один собирательный проток [51, 52]. Таким образом, корковый тубулоинтерстициальный нефрит принимает клиновидный профиль, причем это наблюдается как у экспериментальных мышей, так и у человека [46].
Параллельно с воспалительным ответом хозяина развиваются процессы восходящего фиброза [53]. Он начинается глубоко под почечным уротелием в виде обширных депозитов соединительной ткани. Коллагеновые отложения также распространяются периваскулярно по интерстицию вплоть до коры. Экспериментально на мышах определено, что в развитии фиброза задействованы миофибробласты и эта модель почечного фиброзирования отличается от таковой фиброзирования, обусловленного почечным повреждением либо вследствие односторонней мочеточниковой обструкции, либо ишемии-реперфузии [54, 55], хотя элементы последнего варианта повреждения также имеют место при ОП.
Фиброз почки осложняет ОП хронической болезнью почек [56–58].
Свертывание крови, ишемия и гипоксия предупреждают диссеминацию
В эксперименте доказано, что в очаге инфекции напряжение кислорода равно нулю в течение первых 4 ч заражения [47], это означает, что локальная гипоксия способна вызывать ишемическое повреждение. Феномен гипоксии отчасти связан с существенным усилением метаболизма в эпителиальных клетках проксимального канальца и высоким уровнем цитокинов (IL-1β, -6, TNF-α), что также рассматривается как быстрый ответ эпителия проксимального канальца на бактериальную инвазию.
Другой фактор ишемии – это образование сгустков тромбоцитов в околотубулярных канальцах, которое происходит в течение первых 5–6 ч после инфицирования, что также драматически усиливает дефицит местного тканевого кислорода [47]. Важно отметить, что непосредственного контакта бактерий с эндотелием капилляров не обнаружено, а это означает, что между эпителием и эндотелием существуют некие сигнальные связи. Образование сгустков рассматривается как неизвестный ранее механизм защиты хозяина от бактериальной диссеминации и сепсиса. В эксперименте на животных показано, что антикоагулянтная терапия приводит к быстрому внедрению бактерий в сосудистое русло и смерти от септического шока, что подтверждено результатами аутопсии [47]. Таким образом, сгустки в капиллярах рассматриваются еще как один механизм в защите хозяина, позволяющий локализовать инфекционное повреждение до тех пор, пока разовьются иные защитные реакции, в том числе и нейтрофильная инфильтрация [6].
Обструкция нефрона
Комплексы бактерий, продолжающих размножаться (время генерации для большинства составляет примерно 20 мин), прикрепившихся к тубулярному эпителию, а также располагающихся свободно в просвете, приводят к обструкции канальцев. И это, безусловно, негативно влияет на клубочковую фильтрацию [1]. Отслоенные эпителиальные клетки, их пласты и фрагменты, возникшие вследствие ишемии, также способствуют усилению обструкции [59]. Выше уровня обструкции повышается гидростатическое давление, канальцы расширяются, что и приводит к снижению клубочковой фильтрации. Критическое ее снижение может быстро привести к острой почечной недостаточности [59]. При массивном инфицировании развивается вазоконстрикция артериол и снижение почечного кровотока в целом. Достоверно доказано, что обструкция даже одного нефрона отражается на патофизиологии поврежденной почки, т.е. всего органа. Абсолютно закономерно, что в этой ситуации нарушается функция и ионного транспорта, и юкстагломерулярного аппарата, который контролирует клубочковую фильтрацию и осмолярность мочи, модулируя функции почки посредством продукции ренина и вазопрессина [60, 61].
Межорганная коммуникация
Острое почечное повреждение, развивающееся в нефроне вследствие бактериальной агрессии, по сути являясь локальным процессом, вызывает реакции и со стороны других органов [29]. Вовлечение в процесс острого воспаления сосудистой системы почки в виде ишемии и гипоксии тканей инициирует молекулярные сигналы, в том числе воспалительного свойства и рекрутирование в процесс различных типов клеток, которые со временем согласованно действуют в управлении инфекцией. Хозяин и патогены интегрируются в единый процесс, друг на друга влияя по мере развития воспаления. Естественно, что эти процессы протекают не без участия других органов и систем, в том числе имеются в виду и изменения на генном уровне. Через 8 ч с момента инфицирования почки, по данным биопсий, 60–80 генов отличаются от неинфицированого контроля. Многие из этих генов ассоциированы с воспалением, 25,0% генов регулируются интерфероном (YFN-Y), а повышение его уровня в сыворотке ассоциировано со сверхэкспрессией селезеночного гена (IFN-g) и цитокинами IL-17/-23, что подтверждает взаимосвязь очага почечного воспаления с функцией других органов и систем [62].
Генетическая изменчивость
На предрасположенность к ОП влияют генетические изменения, повреждающие врожденный иммунитет [63]. Делеция отдельных генов с критическими функциями обусловливает формирование фенотипа иммунного дефицита с повышенной чувствительностью к ИМП и полиморфизмом генов у пациентов.
Полиморфизмы в факторе транскрипции IRF3 у УПКП активируют сигнальный путь от ТПР и транскрипцию генов врожденного иммунного ответа, включая цитокины и хемокиновые рецепторы. Если у мышей отсутствует ген IRF3, то у них развивается тяжелый ОП с уросепсисом и почечными абсцессами [64], что формируется вследствие недостаточной активации интерферонов-α и- β. Этот факт подтвержден у детей и взрослых [36].
Результаты клинических наблюдений показывают, что эффективность промотера IRF3 снижается за счет полиморфизма однонуклеотидных последовательностей, что встречается примерно у 80,0% пациентов с неосложненным ОП и этот феномен повышает риск развития новых эпизодов данного заболевания [36].
Подобная ситуация встречается и при полиморфизме гена рецептора CXCR1, связанного с продукцией IL-8.
У мышей с отсутствием рецептора IL-8 развивается тяжелый ОП вследствие дисфункции нейтрофилов [65]. Данный факт доказан и в группах пациентов с этой патологией [66–69]. Были определены и другие полиморфизмы, связанные с высоким риском развития ОП [70, 71].
Кишечная палочка с Р-фимбриями может связываться с гликолипидами, которые являются антигенами системы Р групп крови. Определив группу крови, можно предсказать характеристику рецепторов покровного слоя лоханки, чашечек и сосочков. Люди с этой группой крови оказались более устойчивыми к бактериальной инфекции, вызванной УПКП с Р-фимбриями [72]. Экспрессия эпителиальных рецепторов также зависит от групп крови АВ0, и люди с антигеном А группы крови имеют более высокие риски инфицирования УПКП с наличием Р-фимбрий [73]. Исследование восприимчивости к ОП на основе опроса нескольких поколений семей, склонных к этому заболеванию, выявило его повышенную частоту по сравнению с контролем. Данное обстоятельство связано с пониженной экспрессией рецептора CXCR1, влияющего на уровень восприимчивости ОП [73]. Таким образом, восприимчивость к ОП может быть унаследована.
