Введение. Рак предстательной железы (РПЖ) входит в число наиболее часто встречающихся опухолей у мужского населения России как по заболеваемости, так и в структуре смертности от злокачественных новообразований [1]. Скрининговым тестом на РПЖ является измерение концентрации простатспецифичного антигена (ПСА) в крови, положительный результат которого, подтвержденный при повторном исследовании, может служить показанием к биопсии. Морфологическое исследование вследствие гетерогенности и мультифокальности опухолей не всегда позволяет выявлять РПЖ в биоптатах предстательной железы и требует высокой квалификации патолога. Зачастую доброкачественные гиперпластические железистые структуры (ДГПЖ) соседствуют с фокусами интраэпителиальной неоплазии (ПИН) и аденокарциномы различной степени дифференцировки [2].

В настоящее время накоплены данные о молекулярно-генетических нарушениях при РПЖ, некоторые из которых рассматривают в качестве диагностических маркеров. В частности, методом дифференциального дисплея выявили кДНК гена PCA3 (prostate cancer gene 3), гиперэкспрессия которого характерна для РПЖ. Продукт гена PCA3 относится к некодирующим РНК, представлен рядом изоформ из-за альтернативного сплайсинга, разных сайтов инициации и терминации транскрипции, локализован внутри интрона 6-го гена PRUNE2, задействованного в регуляции клеточной пролифераци [3, 4]. Показано, что в аденокарциноме предстательной железы экспрессия РСА3 в 60–70 раз превышает таковую в морфологически не измененной ткани [5]. Анализ экспрессии РСА3 относительно тканеспецифичного контроля – экспрессии гена KLK3 – с помощью набора Progensa («Gene-Probe Inc.», США) в моче применяют для решения вопроса о целесообразности повторной биопсии у пациентов с подозрением на РПЖ при повышенном уровне ПСА и отрицательном результате первой биопсии [6]. Кроме того, опубликованы результаты исследований, проведенных более чем у 3000 пациентов, которые показали, что анализ экспрессии PCA3 в моче можно использовать при первичной диагностике как независимый предиктор обнаружения РПЖ [7].

Ген РСА3 гиперэкспрессируется в опухоли относительно нормальной ткани. В то же время любой онкомаркер, концентрация которого при наличии опухоли превышает его концентрацию в норме на некоторую величину, имеет, как правило, «серую зону» пограничных значений. С этим связана проблема выбора пограничного значения экспрессии PCA3. Например, при использовании Progensa пороговое значение для диагностики РПЖ составляет 35 баллов, для повышения чувствительности теста в скрининговых целях оно может быть снижено до 20–25 баллов [8, 9]. Показано, что анализ экспрессии РСА3 в моче не может быть использован для диагностики предопухолевых изменений (РПЖ против ПИН или ДГПЖ), хотя различие экспрессии этого гена в биоптатах РПЖ, ПИН, ДГПЖ и в норме, а также влияние инвазивных диагностических процедур и других факторов на его экспрессию остаются предметом дискуссии [10–12].

Анализ экспрессии РСА3 – информативный метод в диагностике РПЖ, однако для широкого применения РСА3 как индивидуального маркера целесообразно увеличить его диагностическую точность. Это может быть достигнуто при мультиплексном анализе РСА3 вместе с другими генами, экспрессия которых специфична для РПЖ, например TMPRSS2:ERG. При РПЖ образуются химерные гены, представляющие собой продукт слияния 5’-нетранслируемой области гена TMPRSS2, с генами семейства транскрипционных факторов ETS. В подавляющем большинстве случаев химерный ген представлен TMPRSS2:ERG, который выявляют в 30–50% случаев РПЖ. Образование этого химерного онкогена является ранним событием в канцерогенезе РПЖ. Существуют различные данные о его частоте в гиперплазированной ткани и предраковых изменениях предстательной железы: одни авторы свидетельствуют об отсутствии TMPRSS2:ERG при ДГПЖ и в нормальной ткани органа [13, 14], другие обнаружили его экспрессию в 8% ДГПЖ и 15% морфологически не измененной ткани, непосредственно прилегающей к РПЖ [15]. В очагах ПИН высокой и низкой степеней (ПИН ВС и ПИН НС соответственно) экспрессия TMPRSS2:ERG выявлена в 10–15% случаев [16, 17]. Иными словами, при высокой специфичности этого изменения для РПЖ относительно нормы значение TMPRSS2:ERG как маркера дифференциальной диагностики РПЖ и предраковых изменений, прежде всего ПИН ВС, требует дополнительной валидации.

Цель настоящей работы: определить экспрессию генов РСА3 и TMPRSS2:ERG в биоптатах ДГПЖ, ПИН НС и ПИН ВС, РПЖ для выяснения диагностической значимости экспрессии указанных генов при доброкачественных и предраковых изменениях в предстательной железе.

Материалы и методы. Исследовали материал 53 биопсий, включивший 10 образцов РПЖ (аденокарцинома), 9 – ПИН ВС, 21 – ПИН НС, 13 – ДГПЖ без ПИН. Все образцы были охарактеризованы патоморфологом и аннотированы необходимыми клиническими данными.

Выделение тотальной РНК осуществлено с помощью набора RecoverAll™ Total Nucleic Acid Isolation Kit («Ambion», США) методом сорбции нуклеиновых кислот на колонке с обработкой ДНКазой, последующей отмывкой спиртовыми растворами и эллюцией РНК в ТЕ-буфер.

Обратная транскрипция выполнена методом отжига случайных олигонуклеотидов с помощью набора High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit («Applied Biosystems», США) в объеме реакционной смеси 20 мкл в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя.

Полимеразная цепная реакция в реальном времени (ПЦР-РВ) проведена для определения экспрессии генов РСА3, TMPRSS2:ERG относительно внутреннего и тканеспецифического контроля (генов GAPDH и KLK3 соответственно). Реакционная смесь содержала 1 мкл раствора кДНК, полученного на предыдущем этапе, 10 мкл буферной смеси с полимеразой согласно протоколу производителя, 8 мкл деионизированной воды и 1 мкл смеси праймеров и TaqMan-зонда: РСА3 – Hs01371939_g1 (FAM), TMPRSS2:ERG – Hs03063375_ft (FAM), KLK3 – Hs02576345_m1 (FAM), GAPDH – huGAPDH-4326317E (VIC) («Applied Biosystems», США). Температурные параметры: 95°С 10 мин, затем 47 циклов 95°С 15 с, 60°С 1 мин. Каждый ген в отдельном образце анализирован в трех повторениях, определено среднее значение порогового цикла (Ct – threshold cycle), максимальное значение которого принято равным 45 циклам (рис. 1). ПЦР-РВ проведена в детектирующем термоциклере StepOnePlus («Applied Biosystems», США).

Статистический анализ результатов включил определение показателя deltaCt исследуемого гена относительно эндогенного контроля, сравнение групп по этому показателю с помощью двустороннего критерия Стьюдента с поправкой Welch, определение 95% доверительных интервалов (ДИ). Определена диагностическая точность при учете РСА3 как отдельного маркера, а также комбинации гиперэкспрессии РСА3 и экспрессии TMPRSS2:ERG. При сравнительном анализе по показателю deltaCt и построении диаграмм применены программы GraphPad Prism 6, Microsoft Exel.

Результаты. Качество выделения мРНК и обратной транскрипции проверено по внутреннему контролю – экспрессии гена GAPDH, выявленной во всех анализируемых образцах. В качестве эндогенного контроля был использован KLK3, кодирующий ПСА, характеризующийся тканеспецифичной экспрессией и часто применяемый в качестве такого контроля при сравнительном анализе экспрессии генов в предстательной железе [18, 19]. Одновременно с контролями определили Ct для исследуемых генов РСА3 и TMPRSS2:ERG. Для каждого образца вычислен показатель deltaCt, равный Сt(PCA3)–Ct(KLK3). Затем определили среднее значение deltaCt и стандартные отклонения в каждой из четырех исследуемых групп. Чем интенсивнее экспрессировался РСА3, тем ближе была точка Ct этого гена к Ct гена KLK3 и, соответственно, меньше был показатель deltaCt. При ДГПЖ значение deltaCt в среднем составило 8,28±3,13, при ПИН НС – 8,56±2,64, при ПИН ВС – 8,98±1,69, при РПЖ – 1,08±2,36. Показано, что deltaCt не различается у пациентов с ДГПЖ, ПИН ВС, ПИР НС (р>0,05), тогда как достоверно увеличен при РПЖ относительно любой из трех вышеперечисленных групп (р<0,0001, рис. 2). В дальнейшем ДГПЖ и ПИН разной степени объединили в одну контрольную группу (43 образца условной нормы). При сравнении deltaCt между РПЖ и объединенной условной нормой различия также были статистически значимыми (р<0,0001).

Далее вычислены диагностическая чувствительность и специфичность, а также диагностическая точность гиперэкспрессии РСА3. Проведение ROC-анализа показало, что AUC (площадь под ROC-кривой с 95% ДИ, р<0,0001) составляет 0,98±0,02, что является высоким показателем для лабораторных тестов. Среднее значение deltaCt условной нормы составило 8,56±2,59, при этом 90% значений deltaCt РПЖ лежали за пределами двух стандартных отклонений от объединенного контроля. При пороговом уровне deltaCt, равном 3,22, достигается оптимальное соотношение диагностических чувствительности и специфичности: 90% (95% ДИ – 55,5–99,8) и 97,7% (95% ДИ – 87,7–99,9) соответственно.

Экспрессия химерного онкогена TMPRSS2:ERG отсутствовала в ДГПЖ, ПИН низкой и высокой степеней, но была выявлена в 40% (4 из 10) случаев РПЖ. Как и в случае РСА3, первые три группы были объединены в одну контрольную группу. Если рассматривать гиперэкспрессию РСА3 с пороговым уровнем deltaCt, равным 3,22, и наличие экспрессии TMPRSS2:ERG как комбинацию двух независимых классифицирующих признаков при отнесении образца к контролю или РПЖ, то в нашем исследовании диагностическая точность не менялась (90%). Однако с учетом частоты встречаемости TMPRSS2:ERG она может возрасти до 94% при увеличении выборки РПЖ.

Обсуждение. Гиперэкспрессию РСА3 в РПЖ относительно контрольной группы (ДГПЖ, ПИН) наблюдали в 90% случаев, что соответствует данным других авторов, описывающих увеличение экспрессии этого гена при РПЖ в 90–95% случаев [10]. Полученные результаты согласуются с теми работами, в которых гиперэкспрессия РСА3 при РПЖ достоверно отличается от экспрессии при других патологических изменениях предстательной железы. Однако представленные результаты не подтверждают различия экспрессии РСА3 при ПИН ВС относительно ДГПЖ [20]. Полученные в настоящей работе результаты характеризуют экспрессию РСА3 в тканях. Оценка экспрессии этого гена в осадке мочи рекомендована для определения РПЖ при решении вопроса о повторной биопсии при возрастающем уровне ПСА и отрицательном результате первой биопсии, но также не позволяет дифференцировать ПИН и ДГПЖ от РПЖ [21]. Причем это показано не только в первых работах по использованию теста на РСА3 в осадках мочи с пороговым уровнем РСА3-Score 35, но и в мета-анализе с выделением подгрупп ПИН ВС и атипичной мелкоацинарной пролиферации при пороговом уровне РСА3-Score 20 [22].

Различия результатов могут объясняться, в частности, разными вариантами дизайна олигонуклеотидов. Ген РСА3 состоит из четырех экзонов, его РНК подвергается альтернативному сплайсингу, чаще всего за счет экзона 2, возможны различные варианты сайтов инициации и терминации транскрипции, сайтов полиаденилирования в экзоне 4 в разных клетках.

В итоге экзон 2 присутствует в 5% кДНК, все остальные экзоны содержат 65% транскриптов, а простатспецифичной экспрессией характеризуются только экзоны 3 и 4. Так, описаны варианты праймеров для ПЦР, которые позволяли амплифицировать участок кДНК РСА3 только, например, в клеточной линии LNCaP, метастазах РПЖ, но не в норме или при ДГПЖ [23]. В исследованиях экспрессии РСА3 при РПЖ с помощью ПЦР-РВ предпочитают использовать только простатспецифичные праймеры и зонды на область соединения экзонов 3 и 4 [24], что делает их в значительной мере комплементарными не только кДНК, но и геномной ДНК и требует обработки образца избытком ДНКазы перед обратной транскрипцией. Рекомендованный компанией «Applied Biosystems» вариант дизайна праймеров/зонда Hs01371939_g1 был успешно применен к ПЦР-РВ кДНК РСА3 в настоящей работе и другими авторами [25]. Способ выражения экспрессии РСА3 относительно контроля KLK3 также различается: при диагностике с помощью набора Progensa – это РСА3-Score, равный умноженному на 103 отношению количества копий мРНК PCA3 к количеству копий мРНК KLK3 [7]; при ПЦР-РВ – другие варианты, например, 1/(Ct(PCA3)/Ct(KLK3)) [25] или Сt(PCA3)–Ct(KLK3) в настоящей работе. Не является принципиальным характер представления относительной экспрессии РСА3. Существенно, чтобы независимо от способа расчета этот показатель позволял установить пороговый уровень с высокой диагностической точностью.

Частота выявления экспрессии TMPRSS2:ERG при РПЖ в настоящей работе составила 40%, в нормальной ткани TMPRSS2:ERG отсутствовал, что в целом соответствует данным других авторов [26, 27]. Широкий диапазон частоты (30–50%) обнаружения TMPRSS2:ERG обусловлен как различиями методов детекции, так и объективными причинами. Среди последних можно отметить репрессию андрогенчувствительных генов, в том числе TMPRSS2:ERG, в гормоночувствительных опухолях при терапии антиандрогенами; преобладание ERG-негативных клеток в опухолях, несущих точковые мутации SPOP и делеции CDH1 [28].

Для определения TMPRSS2:ERG разные авторы используют иммуногистохимическое окрашивание на ERG, FISH с зондами на области делеции (транслокации) или ПЦР-РВ на мРНК TMPRSS2:ERG [29]. В нашей работе не было обнаружено образцов ПИН ВС с TMPRSS2:ERG. Вместе с тем, по данным других авторов, частота выявления этого гена в ПИН ВС составляет 10–20%, причем чувствительность FISH выше, чем у ПЦР-РВ [26–30]. С одной стороны, иммуногистохимическое определение экспрессии ERG представляется наиболее обоснованным как выявление конечного белкового продукта независимо от метода образования химерного онкогена (делеция или транслокация), от степени деградации мРНК в парафиновом блоке. Кроме того, описано около 20 вариантов мРНК TMPRSS2:ERG, из которых наиболее частый – это продукт слияния экзона 1 TMPRSS2 с экзоном 4 ERG (именно он был исследован в настоящей работе и большинством других авторов). При этом анализ не учитывал вторую по частоте изоформу – слияние экзона 2 TMPRSS2 с экзоном 4 ERG [31]. С другой стороны, экспрессия ERG и, соответственно, чувствительность иммуногистохимического метода могут быть снижены при гормонорезистентном РПЖ, когда в 20% случаев наблюдают TMPRSS2:ERG по данным FISH с отсутствием экспрессии ERG, а также в РПЖ с нейроэндокринной дифференцировкой при репрессии сигнального пути андрогенового рецептора [32].

По данным FISH-анализа некоторых зарубежных авторов, частота TMPRSS2:ERG в ДГПЖ составляет 8% [30], тогда как в работах других исследователей и в нашей работе химерный ген отсутствовал [33]. Следует отметить, что в упомянутой работе с положительным результатом FISH в группе ДГПЖ не выделяли пациентов с ПИН НС, нельзя было исключить больных с невыявленными на тот момент опухолями [30].

В некоторых случаях гиперэкспрессия ERG обусловлена не TMPRSS2:ERG, а слиянием ERG с другими андрогензависимыми генами (SLC45A3 или NDRG1); кроме того, нельзя исключать несоответствия результатов вследствие генетической гетерогенности мультифокального РПЖ по наличию TMPRSS2:ERG в разных опухолевых клонах [33].

Экспрессию TMPRSS2:ERG в ПИН ВС рассматривают как неблагоприятный критерий: ПИН с ERG-позитивным статусом чаще и быстрее переходит в РПЖ, чем с ERG-негативным статусом [34]. По данным мета-анализа, FISH и ПЦР-РВ обладают схожей чувствительностью, превышающей таковую при иммуногистохимическом анализе, при этом FISH охарактеризован как более специфичный метод выявления TMPRSS2:ERG в ткани [27]. Повышение чувствительности панели экспрессионных маркеров, изученных в настоящей работе, может быть достигнуто при мультиплексном анализе с другими генами, экспрессия которых специфична для РПЖ, например KLK2, DLX1 и др. [35]. Также высказывают точку зрения, согласно которой для повышения точности диагностики экспрессию PCA3 целесообразно включать в калькуляторы рисков, куда входят и другие данные обследования пациента, например возраст, уровень ПСА, объем предстательной железы, результат пальцевого ректального исследования, индекc phi (prostate health index, учитывающий концентрации свободного и общего ПСА, а также (-2)проПСА) [36, 37]. Разработка тест-систем молекулярных маркеров для диагностики РПЖ идет возрастающими темпами; за последние два года помимо зарегистрированных FDA-тестов для оценки показателя рhi и набора Progensa разработаны наборы OncotypeDX и ProlarisScore (детекция экспрессии 12-го и 46-го генов соответственно, которые вовлечены в канцерогенез при РПЖ) [38].

Заключение. Таким образом, наше исследование подтверждает гиперэкспрессию РСА3 в биоптатах РПЖ по сравнению с ПИН и ДГПЖ. В то же время анализ экспрессии РСА3 и химерного онкогена TMPRSS2:ERG не позволяет проводить дифференциальную диагностику ДГПЖ, ПИН НС и ПИН ВС. Анализ экспрессии этих генов с помощью предложенной модификации ПЦР-РВ при пороговом уровне deltaCt 3,22 позволяет с диагностической точностью в 90% выявлять в биоптатах РПЖ.