Spermatogenesis recovery following allogeneic transplantation of undifferentiated Sertoli cells in experimental model of bilateral abdominal cryptorchidism


A.Yu. Kulibin, E.A. Malolina, S.P. Jacyk, Je.K. Zhamynchiev, G.V. Kuzin

Koltzov Institute of Developmental Biology of RAS; Gamaleya Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology of Minzdrav of Russia; Department of Reproductive Health of Scientific Center of Children's Health; Faculty of Medicine of the Peoples’ Friendship University of Russia
This study explores the effect of transplantation of undifferentiated Sertoli cells in the testicular tissue of an experimental animal model of bilateral abdominal cryptorchidism. Effectiveness of undifferentiated Sertoli cell transplantation was assessed after 1 and 3 months after injection. Partial restoration of seminiferous tubules was found to occur after transplantation. In a third of them germ cells of all stages of the differentiation were discovered while they were not found in the control group.

Введение. За последнее время, по данным ВОЗ, частота бесплодия в браке не только не уменьшается, но продолжает расти. Установлено, что доля мужской инфертильности за последние 20 лет увеличилась с 8–10 до 30–40% всех случаев бесплодия [1]. Одна из причин мужского бесплодия – крипторхизм – аномалия, связанная с неопущением одного или двух яичек в мошонку. Дислокация яичка – распространенное нарушение развития репродуктивной системы, встречающееся у 30% недоношенных и 4% доношенных новорожденных [2]. В связи с этим в течение многих лет крипторхизм и его осложнения находятся в центре внимания исследователей и врачей [3].

Традиционные методы лечения крипторхизма недостаточно эффективны. Так, гормональная терапия (с использованием хорионического гонадотропина) – метод лечения, который широко применяется уже более 30 лет, но эффективность его оценивается неоднозначно [4] и по сравнению с группой плацебо не превышает 10% [5]. Другой метод – операция орхипексии (опущение яичка в мошонку) – часто не обеспечивает ожидаемого восстановления сперматогенеза, особенно при двусторонних формах крипторхизма, и проводится больше в профилактических целях.

В настоящее время появляются новые подходы к восстановлению сперматогенеза, пока находящиеся на стадии разработки на лабораторных животных. Один из таких подходов – искусственный гаметогенез – дифференцировка мужских половых клеток из эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток in vitro. В ряде работ ЭСК в культуре под действием специфических индукторов удавалось дифференцировать в гаплоидные мужские половые клетки, которые затем использовали для искусственного оплодотворения [6, 7]. Однако существующие методы искусственного гаметогенеза характеризуются низкой эффективностью: только 0,01% всех клеток достигает гаплоидного состояния. К существенным недостаткам описанного подхода относятся нарушения дифференцировки половых клеток [8, 9], которые происходят из-за отсутствия in vitro естественного микроокружения.

Другой подход к восстановлению мужской фертильности предполагает использование сперматогониальных стволовых клеток (ССК). Разработаны методики выделения, культивирования ССК [10–12] и их трансплантации в семенники животных с нарушенным сперматогенезом [13, 14]. В случае повреждения только половых клеток трансплантации ССК способны восстановить сперматогенез [15]. Однако в случае с крипторхизмом нарушение в значительной степени затрагивает не ССК, а их микроокружение – клетки Сертоли (КС) [16–18]. Клетки Сертоли – соматические клетки семенника, поддерживающие развитие половых клеток; являются основой структуры семенных канальцев, источником многих факторов роста и дифференцировки для половых клеток, выполняют трофическую функцию и многие другие. Без этих клеток развитие половых клеток невозможно.

В литературе отсутствуют данные о восстановлении сперматогенеза после крипторхизма у животных путем аллогенной клеточной трансплантации. Тем не менее на другой модели – локального облучения семенников крыс (так же как и крипторхизм, необратимо нарушающий функцию КС [19]) путем аллогенной трансплантации в интерстициальную ткань семенника недифференцированных КС [НКС]) 12–13-суточных крысятам удалось достичь частичного восстановления сперматогенеза в семенных канальцах реципиента [20].

Цель настоящей работы: исследовать влияние аллогенной трансплантации НКС на восстановление сперматогенеза после моделирования двустороннего абдоминального крипторхизма.

Материалы и методы. В работе были использованы 50 крысят линии Вистар: 30 животным в возрасте 15 дней (возраст выбирали, основываясь на результатах наших предыдущих исследований [3]) проводили операцию по фиксации семенников в брюшной полости (реципиенты), 20 крысят в возрасте 10 дней использовали как доноров НКС для трансплантации. Крыс содержали в стандартных условиях вивария с режимом день/ночь 12 ч/12 ч, воду и корм животные получали ad libitum.

Животные были разделены на 6 групп по 4–5 крыс в каждой.

Контрольная группа (К) – контроль состояния сперматогенной ткани после крипторхизма, крыс выводили из эксперимента на момент низведения семенников из брюшной полости в мошонку через 90 сут. после моделирования крипторхизма.

Контрольная группа (КО-1) – животным после смоделированного 90-суточного двустороннего абдоминального крипторхизма проводили орхипексию и выводили из эксперимента через 1 мес. после операции.

Контрольные группы (КВ-1 и КВ-3) – животным после смоделированного 90-суточного двустороннего абдоминального крипторхизма проводили орхипексию и вводили в интерстициальную ткань семенника среду без клеток, крыс выводили из эксперимента через 1 и 3 мес. после операции соответственно.

Опытные группы (О-1 и О-3) – животным после смоделированного 90-суточного двустороннего абдоминального крипторхизма во время орхипексии вводили суспензию клеток, содержавшую НКС. Крыс выводили из эксперимента через 1 и 3 мес. после операции соответственно.

Моделирование двустороннего абдоминального крипторхизма. Ввиду отсутствия на сегодняшний день животных моделей врожденного крипторхизма в настоящей работе крипторхизм моделировали путем искусственного помещения семенника из мошонки внутрь тела с последующей фиксацией его там. Методика подробно описана нами ранее [3]. После наркотизации животного выполняли нижнесрединную лапаротомию. Семенник выводили в операционную рану, фиксировали его к париетальной брюшине передней брюшной стенки за край капсулы нитями Prolene 5/0 («Johnson & Johnson», США) с помощью атравматической иглы. После выполнения аналогичной фиксации семенника с другой стороны операционную рану передней брюшной стенки послойно зашивали наглухо.

Получение суспензии клеток для трансплантаций. Суспензию НКС получали из семенников 10-суточных крысят (линия Вистар). Животных декапитировали, выделяли семенники, помещали в раствор Хэнкса (без Ca2+ и Mg2+), снимали белочную оболочку и разрыхляли ткань семенника. Затем семенники переносили в 14-миллилитровые центрифужные пробирки со стерильным раствором Хэнкса и добавляли 20 мкл/мл (1:50) пенициллин/стрептомицина (Пан-Эко), инкубировали с антибиотиками 5 мин. За это время семенники опускались на дно. Надосадочную жидкость отбирали и заменяли на раствор коллагеназы IV 1 мг/1,5 мл с ДНКазой I 0,04%. Инкубировали в растворе 15 мин при 34°С. После инкубации с коллагеназой освобожденные от интерстициальной ткани семенные канальцы промывали 3 раза раствором Хэнкса. Затем добавляли к канальцам 5 мл раствора трипсина (0,25%)+1 мМ ЭДТА («Invitrogen», США), инкубировали 15 мин при 34°С. После инкубации для остановки действия трипсина в раствор добавляли 5% ФСК (фетальная сыворотка плодов коровы, HyClone), затем промывали канальцы 3 раза раствором Хэнкса, разбивали канальцы на отдельные клетки пипетированием. Суспензию клеток пропускали через фильтры размером пор ~200−300 мкм, а затем 40 мкм, промывая раствором Хэнкса. Клетки осаждали центрифугированием при 300 g 10 мин. Отбирали надосадочную жидкость, наливали 2,9 мл Хенкса, ресуспендировали осадок и добавляли гипотонический раствор (0,7 мл Хенкса и 6,4 мл деионизированной стерильной воды), центрифугировали при 300 g 5 мин. В результате гипотонической обработки суспензии клеток разрушались почти все половые клетки и эритроциты. Надосадочную жидкость убирали и ресуспендировали осадок в среде (ДМЕМ:F12 1:1), подсчитывали число клеток в камере Горяева. Затем для обогащения суспензии клеток для трансплантации НКС клетки высаживали на чашки Петри, покрытые желатиной в среде (α-MEM:F12, 5% FBS, 2% Пен./Стреп., L-глутамин [1:50], пируват натрия [1:100, раствор 1,1 мг/мл]) в концентрации 0,3∙106 клеток на 1 см2. Культивировали клетки в течение 1 сут. За это время к желатину прикреплялись все жизнеспособные НКС. Через 1 сут. готовили суспензию клеток в среде (DMEM, 10% ДНКаза I [2 мг/мл], 5% витального красителя трипанового синего [0,4%-ный раствор]).

Трансплантация клеточных суспензий. Семенники выводили в операционную рану. Клеточную суспензию вводили с помощью поршневого микроинъектора через капилляр (диаметр кончика – 60 мкм). Перед введением капилляра иглой размером 20G в белочной оболочке семенника делали перфоративное отверстие. Клетки вводили в интерстициальную ткань семенника небольшими порциями, добиваясь ее равномерного распределения. Контроль введения осуществлен по окраске ткани семенника трипановым синим. В каждый семенник опытной группы крыс вводили по 150 мкл суспензии клеток, в которой содержалось 2∙106 клеток. Контрольным животным (группы КВ-1 и КВ-3) вводили среду того же состава и объема, но без НКС. Введение осуществляли под микроскопом при общем увеличении в 16 раз.

После завершения трансплантации яичко низводили в мошонку с соблюдением мер предосторожности, выполняли аналогичную трансплантацию с другой стороны, послеоперационную рану ушивали наглухо.

Качественный и количественный гистологический анализ состояния сперматогенной ткани. Животных выводили из эксперимента путем передозировки диэтилового эфира в эксикаторе, извлекали семенники и взвешивали, фиксировали в 4%-ном параформальдегиде (pH 7,4), проводили через восходящий градиент спиртов и ксилол и заключали в парафин. Готовили срезы толщиной 7 мкм и окрашивали их гематоксилином и эозином. Для качественной оценки состояния сперматогенной ткани срезы просматривали и фотографировали на микроскопе Leica DM5000B (США). Для количественной оценки на трех срезах семенника (расстояние между срезами ~200 мкм) подсчитывали общее количество канальцев, количество канальцев, содержащих все типы дифференцирующихся половых клеток (канальцы с нормальной структурой сперматогенного эпителия), количество канальцев без сперматид, количество канальцев без сперматид и сперматоцитов и количество канальцев без половых клеток (результаты подсчетов выражали в процентах).

Статистический анализ результатов. Количест-венные данные анализировали в статистическом пакете STATISTICA 8.0 («StatSoft», США). Сравнение средних значений контрольных и экспериментальных выборок проводили с использованием непараметрического критерия Mann–Whitney t при стандартном уровне значимости p≤0,05.

Результаты и обсуждение. Результаты измерения массы семенников. Средняя масса семенника у животных через 1 и 3 мес. после их низведения и трансплантации клеток составила соответственно 522 и 528 мг, что достоверно выше, чем у животных контрольных групп (рис. 1). У крыс контрольной группы К после 90-суточной экспозиции семенников в брюшной полости средняя масса семенника был значительно и достоверно меньше, чем у крыс других контрольных групп, и составляла 280 мг.

В контрольной группе КО-1 через 1 мес. после низведения семенников в мошонку его масса увеличилась и составила 428 мг. Такая же картина наблюдалась и в контрольной группе КВ-1 (через 1 мес. после низведения семенников и введения среды), в которой данный показатель составил 421 мг, через 3 мес. (группа КВ-3) он незначительно снижался в среднем до 392 мг.

Качественная гистологическая оценка состояния сперматогенной ткани. Для оценки эффекта аллогенной трансплантации НКС было выполнено гистологическое исследование сперматогенной ткани во всех группах животных.

В контрольной группе К во всех семенных канальцах отсутствовали удлиняющиеся и округлые сперматиды (рис. 2, а), а в части канальцев также мейотические клетки (рис. 2, б, в), что свидетельствует о глубоком нарушении развития мужских половых клеток. Цитоплазма КС, в норме заметная только в области ядра, сильно разрасталась и была заполнена вакуолями. Ядра КС часто смещались к просвету канальца, что редко можно заметить в норме только на стадии спермиации (рис. 2, б). Во многих канальцах наблюдалась остановка (блок) сперматогенеза на стадии прелептотены-лептотены или зиготоны (рис. 2, в, г соответственно). Об этом свидетельствовало накопление ядер сперматоцитов I порядка на соответствующих стадиях дифференцировки, расположенных в 2−3 ряда, чего никогда не бывает в норме. Гибнущие половые клетки нередко слущивались в просвет канальца (см. рис. 2, г).

В семенниках контрольной группы КО-1 через 1 мес. после низведения семенников из брюшной полости в мошонку восстановления развития мужских половых клеток не происходило, напротив, нарушения структуры сперматогенной ткани становились более значительными. Во всех без исключения семенных канальцах полностью нарушался сперматогенез (рис. 2, д); из половых клеток в канальцах в большинстве случаев оставались лишь сперматогонии (рис. 2, е). В цитоплазме КС увеличивалось число вакуолей (рис. 3, в). Ядра КС и сперматогониальных клеток во многих канальцах покидали базальную мембрану. В некоторых канальцах полностью отсутствовал просвет (см. рис. 2, д). Происходящие изменения в сперматогенной ткани после опущения семенников назад в мошонку свидетельствуют о необратимости процессов нарушения сперматогенеза у крыс с искусственным крипторхизмом.

В семенниках контрольной группы КВ-1 через 1 мес. после орхипексии и введения среды без клеток картина сперматогенеза немного отличалась от таковой в группе КО-1, но в целом была схожей. Нарушение развития мужских половых клеток имело место во всех семенных канальцах (рис. 3, а).

В цитоплазме КС в некоторых канальцах присутствовали вакуоли (рис. 3, б). Число вакуолей в КС и число канальцев, содержащих такие клетки, было меньше, чем в контрольной группе КО-1. Во многих канальцах в герминативном эпителии можно было заметить ядра лишь сперматогониальных клеток и КС; ядра часто смещались в сторону просвета (см. рис. 3, б). Важным отличием от группы КО-1 было появление заметного числа канальцев с мейотическими клетками (см. рис. 3, а). В единичных семенниках происходило замещение интерстициальной ткани соединительной, увеличивались число и размер кровеносных сосудов, канальцы расходились друг от друга. В некоторых канальцах (1−2 на поперечный срез семенника) происходила гибель всех клеток, и канальцы содержали лишь клеточный дебрис. Встречались также остовы канальцев, не содержащих ни половых, ни соматических клеток (рис. 3, в).

В семенниках контрольной группы КВ-3 через 3 мес. после орхипексии и введения среды без клеток гистологическая картина изменений сперматогенеза была хуже, чем через 1 мес. после введения среды. Сперматогенез был нарушен во всех семенных канальцах (рис. 3, г). В сперматогенном эпителии присутствовали только КС и немногочисленные сперматогонии. Цитоплазма КС сильно вакуолизирована. В некоторых канальцах ядра половых и соматических клеток были беспорядочно разбросаны по всей толще сперматогенного эпителия, а не находились у базальной мембраны (рис. 3, д). Канальцы со сперматоцитами встречались редко. Интерстициальная ткань частично замещалась соединительной, канальцы расходились, увеличивалось число кровеносных сосудов (рис. 3, е).

В опытной группе крыс О-1 через 1 мес. после низведения семенников из брюшной полости и трансплантации НКС наблюдалось полное восстановление сперматогенеза в части семенных канальцев (рис. 4, а, б). В канальцах с восстановившимся сперматогенезом можно было наблюдать все типы дифференцирующихся половых клеток: от сперматогониальных клеток до удлиняющихся сперматид (на рис. 4, б представлен поперечный срез канальца на стадии спермиации). Половые клетки разных генераций в таких канальцах располагались концентрическими слоями, их число и положение в слоях соответствовало норме. Наряду с канальцами с полностью восстановленной структурой сперматогенного эпителия мы наблюдали также канальцы с частичным восстановлением эпителия (рис. 4, в), в канальце отсутствовали постмейотические половые клетки, число сперматоцитов было выше нормы, что может свидетельствовать о блоке сперматогенеза на этой стадии развития клеток. Встречались также канальцы без половых клеток и канальцы только со сперматогониальными клеткам, но их было немного.

В опытной группе О-3 через 3 мес. после проведения трансплантации нами также были обнаружены канальцы с полностью восстановившимся сперматогенезом (рис. 4, г, д). В отличие от опытной группы О-1 в этой группе в единичных семенниках мы наблюдали восстановление сперматогенеза в большинстве семенных канальцев. В то же время необходимо отметить наличие обширных зон опустошенных канальцев в некоторых семенниках (рис. 4, е), чего мы не наблюдали в группе О-1. Так же как и в опытной группе О-1, в канальцах с восстановившимся сперматогенезом определялись все типы дифференцирующихся половых клеток – от сперматогониальных клеток до удлиняющихся сперматид (см. рис. 4, д). Половые клетки разных генераций в таких канальцах располагались слоями, их число и положение соответствовали норме.

Количественный гистологический анализ состояния сперматогенной ткани. Для более полной оценки восстановления сперматогенной ткани после трансплантации НКС мы определили долю канальцев с разной степенью нарушения сперматогенного эпителия у животных из опытных и контрольных групп. Доля канальцев с нормальной структурой сперматогенного эпителия, содержащих все типы развивающихся половых клеток, у животных опытных групп О-1 и О-3 в среднем составила соответственно 33,7 и 37,5% (рис. 5, а). У крыс из контрольных групп К, КО-1 и КВ-3 нормальные сперматогенные канальцы в семенниках практически отсутствовали (0, 0,1 и 0,3% соответственно) и только в контрольной группе КВ-1 их доля составляла 2% от всех канальцев. Доля канальцев без сперматид у животных группы О-1 составила 51,9%, группы О-3 – 34,9% (рис. 5, б). У животных контрольных групп наименьшую долю канальцев без сперматид регистрировали через 1 мес. после опущения семенников в мошонку (2,6%, группа КО-1), а наибольшую – у животных через 3 мес. крипторхизма (63,4%, группа К), у животных через 1 и 3 мес. после опущения семенников и введения среды доля таких канальцев составляла 37,5 и 20% соответственно. Доля канальцев без сперматид и сперматоцитов у животных из опытных групп О-1 и О-3 составила соответственно 14,4 и 27,6 % (рис. 5, в). У животных из контрольных групп наименьшая доля таких канальцев была в группе К (35,6 %), а наибольшая – в группа КО-1 (95,7 %), у животных групп КВ-1 и КВ-3 доля канальцев без мейотических и постмейотических половых клеток составила 60,4 и 75,6% соответственно. Реже всего во всех группах животных в семенниках встречались канальцы без половых клеток, у которых на базальной мембране присутствовали только КС. У животных из опытных групп О-1 и О-2 такие канальцы были обнаружены в единичных семенниках (0,1%) только в первой группе (рис. 5, г). Такое же количество опустошенных канальцев было и в контрольной группе КВ-1, а через 3 мес. после опущения семенников в мошонку и введения среды, напротив, достигало максимального значения в 4%. У животных групп К и КО-1 доля таких канальцев составила 1 и 1,6% соответственно.

Как видно из результатов измерения массы семенников, качественной и количественной гистологической оценки сперматогенеза, трансплантация НКС в интерстициальную ткань семенников после 3-месячного моделирования крипторхизма способствует восстановлению развития мужских половых клеток в семенных канальцах реципиента. Восстановление сперматогенеза нельзя назвать полным, о чем в первую очередь говорят показатели массы семенников. Так, хотя у животных через 3 мес. после трансплантации масса семенника по сравнению с контрольной группой (К) увеличивалась почти в два раза, достигнув примерно 500 мг, она была значительно ниже нормальной (2–3 г для крыс в возрасте 6–7 мес.). Мы предполагаем, что масса семенника не достигала нормальных значений из-за недостаточного числа трансплантированных клеток, а также их неравномерного распределения по интерстициальной ткани семенника. Так, по данным [19], у крыс, подвергнутых локальному облучению семенников (γ-облучение, доза 6 Гр) с последующей трансплантацией НКС в интерстициальную ткань, сперматогенез в семенных канальцах реципиента восстанавливался только в тех участках канальца, где в интерстициальной ткани располагались клетки донора.

У животных контрольных групп КО-1, КВ-1 и КВ-3 также констатировали увеличение массы семенника, но не столь значительное, как после трансплантации клеток. Несмотря на это, наше гистологическое исследование не обнаружило восстановительного процесса в сперматогененной системе этих животных. Напротив, по данным количественного анализа, доля канальцев без сперматид снижалась по сравнению с контрольной группой К, тогда как доля канальцев без сперматид и мейотических клеток, а также канальцев без половых клеток увеличивалась. Эти данные свидетельствуют о продолжающейся деградации сперматогенеза у крыс даже после прекращения крипторхизма путем опущения семенников в мошонку. Увеличение же массы семенника, вероятно, связано с утолщением его белочной оболочки, а также разрастанием соединительной ткани в интерстиции. Восстановительный процесс в семенниках после трансплантации клеток хорошо иллюстрируется результатами количественной гистологической оценки сперматогенеза. Так, доля канальцев, содержащих все типы дифференцирующихся половых клеток, в обеих экспериментальных группах превышала 30%, тогда как у большинства контрольных животных такие канальцы отсутствовали. Также обращает на себя внимание значительное (в большинстве случаев статистически достоверное) снижение доли канальцев без сперматид и сперматоцитов, а также канальцев без половых клеток по сравнению с контрольными группами животных.

Обнаруженный нами восстановительный процесс после трансплантации НКС значительно превосходит результаты, полученные у крыс после облучения: по данным Z. Zhang и соавт. (2009) через 13 нед. после аналогичной трансплантации НКС в семенных канальцах реципиента сперматогенез восстанавливался только до стадии мейоза (7% канальцев), канальцы же со сперматидами отсутствовали [20]. Вероятно, это связано с тем, что облучение семенника наносило сперматогенной системе в целом и КС в частности больший, чем при крипторхизме, урон. Это позволяет предположить, что можно добиться и более значительных результатов в восстановлении сперматогенеза после крипторхизма (таких как восстановление фертильности) путем оптимизации условий трансплантации и подбора сроков крипторхизма.

Выводы

  1. На модели двустороннего абдоминального крипторхизма показано, что нахождение семенников в брюшной полости в течение 90 сут. ведет к необратимым дегенеративным процессам в семенниках крыс.
  2. Орхипексия, так же как и введение среды без клеток, не приводит к восстановлению сперматогенеза, наоборот, процессы деградации сперматогенной ткани нарастают.
  3. Трансплантация НКС способствует полному восстановлению сперматогенеза более чем в 30% семенных канальцев реципиента уже через 1 мес. поле операции.

Работы выполнена при поддержке гранта Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные исследования для разработки биомедицинских технологий» (2015 г.).


About the Autors


Corresponding author: Je. K. Zhamynchiev – e-mail: Zhamynchiev@gmail.com


Similar Articles


Бионика Медиа