Sperm DNA fragmentation: association with semen parameters in young men


L.V. Osadchuk, D.A. Tataru, N.N. Kuznetsova, M.A. Kleshev, E.V. Markova, A.V. Svetlakov

1Federal Research Center Institute of Cytology and Genetics of the Siberian Branch of the RAS, Novosibirsk; 2Krasnoyarsk Center for Reproductive Medicine, Krasnoyarsk; 3Ergin Medical center, Kemerovo
Aim. Abnormal sperm DNA integrity is an important risk factor for male infertility. The aim of this work was to examine sperm DNA fragmentation in a cohort of young male volunteers (n=111; age 21.0±0.2 years) from the general population and establish the association between the level of sperm DNA fragmentation and sperm functional parameters.
Materials and methods. Sperm DNA fragmentation index (DFI) was determined by SCSA (sperm chromatin structure assay) using flow cytometry. Standard semen parameters (concentration, motility, and morphology) were evaluated according to the WHO
guidelines (2010).
Results and conclusions. In the study cohort, 79.0%, 12.4% and 8.6% of men had normal (DFI<15%), borderline (15≤DFI<27%) and high (DFI≥27%) levels of fragmentation, respectively. Men with impaired spermatogenesis had greater IDF values (14.53±1.43%) than men with normal semen parameters (8.88±0.77%, p<0.05). There was a statistically significant negative correlation between IFD and ejaculate concentration (r=-0.21, p<0.05), fractions of mobile (r=-0.41, p<0.05) and morphologically normal sperm (r=- 0.34, p<0.05). Testing sperm DNA fragmentation using SCSA technique can be employed in epidemiological studies of male fertility.

Введение. Проблема бесплодия и субфертильности в условиях стагнации численности населения является важнейшей медико-биологической проблемой. В 1990-х гг., когда Россия вступила в период длительной депопуляции, убыль населения за 1995–2008 гг. составила около 6 млн человек, причем главной причиной убыли стала сверхнизкая рождаемость [1].

В настоящее время в России наблюдается устойчивая тенденция к постепенному повышению рождаемости, но опасение вызывает рост числа супружеских пар репродуктивного возраста, страдающих бесплодием, которых насчитывается в настоящее время 15–17%, причем в структуре бесплодия до 45% приходится на долю женщин и 40% – мужчин [1].

В промышленно развитых странах, включая Россию, растет количество мужчин репродуктивного возраста с различными нарушениями репродуктивной функции, что нашло отражение в референтных значениях показателей сперматогенеза, предлагаемых ВОЗ. Если в 1921 г. нормальной концентрацией сперматозоидов в эякуляте считалась 100 млн/мл, пограничной – 60 млн/мл, то через 30 лет этот показатель снизился до 40 млн/мл. В 1992 г. нижней границей нормальной концентрации сперматозоидов ВОЗ предлагала считать 20 млн/мл, а в 2010 г. показатель нормы упал до 15 млн/мл [2].

Генетические факторы вносят вклад в нарушение репродуктивной функции у мужчин и могут быть причиной мужского бесплодия в 10–15% случаев [3]. За последние годы накоплены данные о том, что нарушения в организации генетического материала и структуры хроматина сперматозоидов негативно отражаются на мужской фертильности, способности выносить ребенка и на здоровье потомства. Установлено, что повышенный уровень фрагментации ДНК в сперматозоидах ассоциирован с бесплодием, пониженным уровнем оплодотворения, невынашиванием беременности в супружеской паре [4, 5]. Целостность ДНК в сперматозоидах может нарушаться в результате сбоев дифференцировки мужских гамет при переходе от нуклеосомной организации хроматина к протаминовой, что ведет к нерепарированным разрывам ДНК в сперматозоидах [6]. Фрагментация ДНК в дифференцирующихся половых клетках семенников может быть следствием незавершенного процесса апоптоза [6–8]. Еще один возможный механизм нарушения целостности ДНК в сперматозоидах обусловлен оксидативным стрессом, вызываемым избыточной продукцией свободных радикалов. Многие авторы рассматривают оксидативный стресс как главный механизм, приводящий к появлению в эякуляте сперматозоидов с фрагментированной ДНК [6–10].

Растущая в последние десятилетия частота мужского бесплодия и субфертильности предполагает, что факторы окружающей среды могут вносить существенный вклад в регуляцию фертильности. Повышенный уровень радиации, загрязнение окружающей среды, а также особенности индивидуального образа жизни служат наиболее вероятной причиной снижения мужской фертильности [10–13]. На сегодняшний день установлено негативное влияние курения, избыточного потребления алкоголя, ожирения, малоподвижности, андрологических заболеваний на сперматогенез и целостность хроматина в сперматозоидах [11–15].

Подавляющее большинство исследований целостности ДНК сперматозоидов проводятся на мужчинах с известным репродуктивным статусом, как правило пациентах репродуктивных центров, страдающих бесплодием, или на донорах сперматозоидов. Популяционных исследований фрагментации ДНК сперматозоидов как возможного индикатора потенциальной фертильности популяции опубликовано незначительное количество [16–19]. Популяционный анализ уровня фрагментации ДНК в сперматозоидах у молодого населения Сибирского региона России не проводился, и представлялось важным охарактеризовать величину и вариабельность этого показателя у мужчин общей популяции, испытывающей влияние разнообразного спектра демографических и средовых факторов. Цель настоящего исследования состояла в оценке уровня фрагментации ДНК сперматозоидов у когорты молодых мужчин из общей популяции и выявлении связи с функциональными показателями сперматогенеза (концентрацией, подвижностью и морфологией сперматозоидов в эякуляте).

Материалы и методы. Формирование выборки мужчин проводилось на основании единых критериев включения: подписание добровольного информированного согласия на участие в исследовании, возраст 18–35 лет, постоянное проживание (не менее 5 лет) в данной местности, отсутствие на момент исследования любых заболеваний в стадии обострения, воздержание от половых контактов и употребления алкоголя в течение 2–3 сут. Выборка мужчин состояла из 111 добровольцев активного репродуктивного возраста (средний возраст – 21,0±0,2 года), привлеченных к обследованию по объявлению и в результате прочитанных лекций по репродуктивному здоровью. Основную часть выборки составляли мужчины европеоидной этнической принадлежности (97%), которые на момент обследования являлись студентами высших учебных заведений. В исследованной когорте 24,3% мужчин характеризовались избыточной массой тела или ожирением с ИМТ≥25,0, 77,5% – употребляли алкогольные напитки, 35,1% – курили; 9,9% обследованных состояли в официальном браке, но никто из вошедших в исследование не имел детей.

Обследование включило физикальный осмотр врачом-андрологом, анкетирование, антропометрию, получение эякулята. Анонимное анкетирование учитывало национальность, особенности сексуальной жизни мужчины, профессиональные вредности, семейное положение. В исследование эякулята, проведенное в соответствии с рекомендациями ВОЗ [2], входило измерение объема, концентрации, доли подвижных и морфологически нормальных сперматозоидов (по строгим критериям Крюгера) и определение уровня фрагментации ДНК сперматозоидов.

Концентрацию сперматозоидов в эякуляте подсчитывали в камере Горяева под световым микроскопом при увеличении 400. Долю подвижных сперматозоидов категории А и Б с прогрессивным прямолинейным движением со скоростью более 25 и 2–25 мкм/с соответственно оценивали с помощью спермоанализатора SFA–500-2 («Биола», Россия). Мазки эякулята окрашивали наборами Diff-Quik («Абрис+», Россия). Морфологию первых 200 сперматозоидов анализировали на микроскопе Carl Zeiss (Германия) при увеличении 1000 под иммерсией в соответствии с критериями нормальности [2].

Уровень фрагментации ДНК в сперматозоидах оценивали методом SCSA (sperm chromatin structure assay – анализ хроматиновой структуры сперматозоида), предложенным [20, 21] с небольшой модификацией [22]. Немедленно после получения эякулята аликвоту объемом 300 мкл замораживали и хранили при температуре -40°С, размораживание не допускалось до проведения анализа [23]. Для анализа фрагментации ДНК сперматозоидов образец подвергали быстрому размораживанию, разводили в TNE-буфере (0,01 М Трис, 1 мМ ЭДТА, 0,15 М NaCl, pH – 7,4) до концентрации сперматозоидов 1 млн/мл. К 100 мкл разведенных в буфере сперматозоидов добавляли 200 мкл кислотного буфера (0,1% Тритон-X-100, 0,15 М NaCl, 0,08 н. HCl, pH – 1,2). После инкубации в течение 30 с добавляли 600 мкл красящего раствора, содержавшего 6 мг/л акридинового оранжевого в растворе 0,2 М Na2HPO4, 1 мМ ЭДТА (дисодиум), 0,15 M NaCl, 0,1 M лимонной кислоты (pH – 6,0). Не позднее одного часа проводили подсчет количества сперматозоидов с красной и зеленой флуоресценцией на флуоресцентном цитометре Guava Easy Cyte Mini («Guava», США). Каждый образец оценивался трижды по 5000 клеток каждый раз. Индекс фрагментации ДНК (ИФД) сперматозоидов рассчитывали как долю клеток с красной флуоресценцией (сперматозоиды с фрагментированной ДНК) от общего количества клеток с красной и зеленой флуоресценцией. Индекс фрагментации ДНК сперматозоидов был определен у 105 испытуемых из 111, поскольку у 6 мужчин наблюдалась тяжелая олигоспермия (концентрация сперматозоидов <1,5 млн/мл) или азооспермия, что не позволяет адекватно оценивать уровень фрагментации ДНК сперматозоидов.

Согласно рекомендациям ВОЗ, заключение о потенциальной фертильности мужчины делается преимущественно по трем показателям – концентрации сперматозоидов в эякуляте, их подвижности и морфологии [2]. Нарушение сперматогенеза характеризуется снижением концентрации сперматозоидов в эякуляте (<15 млн/мл), доли подвижных сперматозоидов (<40%) и доли сперматозоидов с нормальной морфологией (<4%) (одного, попарно или сразу всех). По результатам анализа этих показателей всю когорту мужчин ретроспективно поделили на группы с нормальными показателями сперматогенеза (n=54) и с нарушениями сперматогенеза (n=57).

Статистическую обработку данных проводили с помощью однофакторного дисперсионного анализа, используя пакет статистических программ Statistica 6.0. В рамках дисперсионного анализа для сравнения групп применяли тест Дункана. Корреляционный анализ проводили по методу Пирсона. В таблицах все исследуемые показатели представлены как средняя арифметическая ± ошибка средней. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез составлял p<0,05.

Результаты. В таблице 1 даны значения ИФД сперматозоидов и основные антропометрические и сперматогенные показатели мужчин исследуемой когорты. Средние значения всех показателей сперматогенеза и индекса массы тела для всей группы испытуемых соответствовали норме, а значения ИФД варьировали от 1,89 до 44,98%.

Между группами мужчин с пониженными и нормальными показателями сперматогенеза не наблюдалось достоверных различий по возрасту, росту, массе тела, индексу массы тела и объему эякулята. Группа мужчин с нарушениями сперматогенеза характеризовалась значительным снижением концентрации, подвижности и морфологически нормальных сперматозоидов в эякуляте (p<0,05) по сравнению с группой мужчин с нормальными показателями сперматогенеза (табл. 1). У мужчин с нарушениями сперматогенеза наблюдалось достоверное повышение ИФД сперматозоидов в 1,6 раза (p<0,05) по сравнению с группой с нормальными показателями сперматогенеза (табл. 1) и составило в среднем 14,53±1,43.

Данные корреляционного анализа, проведенного на всей когорте исследованных мужчин, указывают на достоверную взаимосвязь параметров сперматогенеза и уровня фрагментации ДНК сперматозоидов (табл. 2). Выявлены статистически значимые (p<0,05) отрицательные коэффициенты корреляции между ИФД сперматозоидов и концентрацией (r=-0,21), долей подвижных (r=-0,41) и морфологически нормальных сперматозоидов (r=-0,34). Кроме того, установлена тесная положительная взаимосвязь между основными параметрами спермограммы (p<0,05), коэффициент корреляции между концентрацией и долей подвижных сперматозоидов составил 0,80, между концентрацией и долей сперматозоидов с нормальной морфологией – 0,62, а между долей сперматозоидов с нормальной морфологией и подвижностью – 0,70 (табл. 2).

Обсуждение. Средние значения ИФД, полученные в нашей работе, сопоставимы с данными, полученными тем же методом SCSA от мужчин с нормальными показателями сперматогенеза – пациентов или доноров репродуктивных центров [24–26]. Например, ИФД сперматозоидов (среднее значение – 8,4%) у доноров с нормальными показателями спермограммы и доказанной фертильностью [26] совпадал со значениями ИФД (8,9%) у мужчин с нормальными показателями сперматогенеза в нашем исследовании. Значения ИФД сперматозоидов, полученные тем же методом SCSA от 277 датских мужчин в возрасте 19–55 лет [16], варьировали от 11,3 до 16,8%, что сопоставимо с нашими данными. Среднее значение ИФД сперматозоидов, полученное методом SCSA от 207 мужчин в возрасте 19–40 лет из норвежской популяции, составило 12% [19], что полностью совпадает с нашими данными (11,6%).

Проведенное исследование свидетельствует о том, что у молодых мужчин г. Кемерова пониженные показатели сперматогенеза относительно референтных значений ВОЗ [2] встречаются достаточно часто, так как половина обследованных лиц имели те или иные отклонения от нормальных параметров сперматогенеза. Из-за отсутствия детей у всех обследованных мужчин трудно судить о реальной фертильности, тем не менее высокая доля мужчин с отклонениями от нормальных параметров сперматогенеза, ассоциированная с повышенным уровнем фрагментации сперматозоидов, не может не вызывать опасения в отношении тренда повышения субфертильности среди молодого населения изучаемого региона.

При использовании метода SCSA для оценки фрагментации ДНК сперматозоидов предлагается придерживаться предложенных некоторыми авторами (в основном разработчиками метода) референтных значений нормы ИФД<15%, пограничных значений в интервале 15%≤ИФД<27% и высоких значений при ИФД≥27% [20, 21, 27]. Такие пороговые значения установлены для ИФД как предиктора способности мужчин к оплодотворению и успешному исходу беременности при естественном оплодотворении или после применения вспомогательных репродуктивных технологий. Согласно данным [20, 21], у обследованных мужчин с ИФД<15% беременность, как правило, заканчивалась успешно, но при ИФД≥27% беременность вообще не наступала и шансы оплодотворения были близки к нулю, что указывает на высокую прогностическую значимость ИФД в отношении диагностики мужского бесплодия. Согласно предлагаемым эмпирическим критериям, в обследуемой когорте нормальные значения ИФД имели 79% мужчин, пограничные – 12,4% и высокие – 8,6%.

Имеющиеся исследования указывают на тот факт, что структурная целостность ДНК в сперматозоидах ассоциирована с параметрами сперматогенеза [9, 10, 27]. Результаты нашего исследования подтверждают тесную взаимосвязь параметров сперматогенеза и уровня фрагментации ДНК сперматозоидов. Применяя метод SCSA для оценки фрагментации ДНК сперматозоидов у пациентов с бесплодием [24], авторы установили, что коэффициенты корреляции между ИФД, концентрацией, подвижностью и морфологией сперматозоидов составили соответственно -0,31, -0,47 и -0,40 (p<0,05), что несколько выше по сравнению с данными, полученными в настоящем исследовании. Коэффициенты корреляции между ИФД и параметрами спермограммы, близкие по значению к нашим, установлены у мужчин с подтвержденной фертильностью [20]. Следует отметить, что, несмотря на вариабельность значений коэффициентов корреляции в разных исследованиях, все они указывают на то, что сперматозоиды мужчин с отклонениями параметров сперматогенеза от нормы имеют повышенные значения уровня фрагментации ДНК. Поскольку основные показатели сперматогенеза тесно взаимосвязаны, можно предполагать, что в большинстве случаев причиной снижения эффективности сперматогенеза, сопровождающегося повышением ИФД сперматозоидов, может быть действие одного и того же фактора. Увеличение фрагментации ДНК сперматозоидов при нарушениях сперматогенеза у пациентов при некоторых патологических состояниях, обусловленных воспалением, масса незрелых половых клеток и лейкоцитов попадают в эякулят, где служит основным источником свободных радикалов, усиливая процесс фрагментации ДНК в зрелых сперматозоидах [28].

В совокупности имеющиеся в литературе [7, 9, 27] и полученные в данном исследовании факты свидетельствуют о том, что уровень фрагментации ДНК в сперматозоидах является объективным маркером эффективности сперматогенеза. Однако небольшие по величине коэффициенты корреляции между ИФД и параметрами сперматогенеза указывают на то, что уровень фрагментации ДНК в сперматозоидах детерминируется не только параметрами сперматогенеза, но и другими факторами и вследствие этого может служить независимым и дополнительным индикатором качества сперматозоидов. Об этом свидетельствуют данные работы [29], в которой уровень фрагментации ДНК сперматозоидов был значительно выше у мужчин с идиопатическим бесплодием по сравнению с фертильными донорами, причем эти группы не различались по стандартным показателям сперматогенеза. Кроме того, бесплодные пациенты с нарушениями сперматогенеза характеризовались повышенными уровнями повреждений ДНК по сравнению с бесплодными пациентами с нормальными показателями сперматогенеза [24, 25]. Авторы не без основания считают, что анализ фрагментации ДНК сперматозоидов позволяет вскрывать у мужчин с бесплодием отклонения, не выявляемые обычным анализом спермограммы. В практике лечения мужского бесплодия оценка уровня фрагментации ДНК сперматозоидов имеет практическую значимость, так как часто позволяет выявлять причину бесплодия и выбирать адекватную тактику лечения, в том числе с использованием методов вспомогательных репродуктивных технологий [7].

Представляет интерес использовать предложенные референтные значения ИФД сперматозоидов, чтобы оценить их частоты в группах с нормальными и пониженными показателями сперматогенеза у обследованной нами когорты мужчин. У 11,1% мужчин с нормальными показателями сперматогенеза наблюдались пограничные или высокие (9,3 и 1,8% соответственно) значения ИФД и, согласно установленным референтным интервалам, их можно отнести к зоне риска по бесплодию и субфертильности [8, 25]. У 31,4% мужчин с пониженными показателями сперматогенеза наблюдались пограничные или высокие (по 15,7% в обоих случаях) значения ИФД, и они, безусловно, попадают в зону повышенного риска по бесплодию. У остальной части мужчин, несмотря на пониженные показатели спермограммы, выявлены нормальные значения ИФД (<15%), т.е. у них имеются неплохие шансы для достижения беременности. Некоторые авторы [10] считают, что определение целостности ДНК важно только при естественном оплодотворении и оно теряет свою предсказательную силу при применении вспомогательных репродуктивных технологий, так как даже высокие уровни ИФД не предотвращают беременности при оплодотворении in vitro.

Общепринятые функциональные характеристики сперматогенеза, такие как концентрация сперматозоидов в эякуляте, их подвижность и морфологические характеристики (спермограмма), которые служат классическим маркером мужской фертильности, имеют несколько важных ограничений, особенно в отношении оценки потенциальной фертильности популяций человека. Они относительно трудоемки для изучения репродуктивного потенциала популяций, имеют значительную вариабельность и диагностические погрешности. По некоторым оценкам, от 15 до 30% мужчин из бесплодных пар характеризуются, тем не менее, нормальными параметрами спермограммы, что подтверждает ограничение диагностической мощности этого метода [10, 27].

Поиск новых и более эффективных маркеров мужской фертильности привел к пониманию, что целостность ДНК сперматозоидов может являться критическим фактором поддержания высокого репродуктивного потенциала. Так как структурная целостность ДНК жизненно важна для осуществления функции сперматозоида, разработка новых методов по характеристике конденсации и стабильности ДНК сперматозоидов привлекает особое внимание [4, 10]. Накапливающиеся данные о том, что повреждение ДНК сперматозоидов связано с серьезными репродуктивными последствиями [7–9], вызвало значительный интерес к перспективам использования методов оценки целостности ДНК сперматозоидов в эпидемиологических исследованиях мужской фертильности.

Преимущества метода структурного анализа хроматина сперматозоидов (SCSA): быстрая оценка большого количества сперматозоидов, возможность хранить сперматозоиды в замороженном виде и измерять одномоментно много образцов, высокая чувствительность и воспроизводимость результатов, делают его незаменимым в эпидемиологических исследованиях [16–19]. В дополнение к рутинным методам оценки сперматогенеза, которые применяются для популяционной оценки потенциальной мужской фертильности, определение ИФД сперматозоидов методом SCSA в репрезентативных выборках мужчин дает дополнительную прогностическую информацию о репродуктивном потенциале.

Работа выполнена при финансовой поддержке РАН (Комплексная программа сибирского отделения РАН II.2, грант № 0324-2015-0030).


About the Autors


Corresponding author: L.V. Osadchuk – Dr.Bio.Sci., Professor, Leading Research Fellow at the Department of Human Genetics; e-mail: losadch@bionet.nsc.ru


Similar Articles


Бионика Медиа