Введение. Неосложненная инфекция мочевыводящих путей (НИМП) встречается у женщин репродуктивного возраста с анатомически и функционально нормальным мочевым пузырем и мочевыводящими путями. У 25–40% женщин после первого эпизода НИМП в ближайшие 6–8 мес отмечается рецидив заболевания [1].

К факторам, способствующим развитию рецидивирующего бактериального цистита, помимо вирулентности и патогенности возбудителей мочевой инфекции относят как анатомические, так и функциональные изменения: анатомо-физиологические особенности уретры (близость к естественным резервуарам инфекции – анус, влагалище, короткая уретра), «вагинализацию» уретры; нарушения уродинамики нижних мочевыводящих путей (органические или функциональные); гинекологические заболевания (вагиниты, вагинозы, вульвиты, гормональные нарушения), дисбиоз влагалища и атрофию эпителия влагалища, а также нарушение защитной функции гликозаминогликанового слоя слизистой мочевого пузыря, что способствует адгезии возбудителей к слизистой и служит доказанной причиной рецидивов.

Микрофлора женщин с инфекцией мочевыводящих путей (ИМП) характеризуется меньшим количеством лактобактерий нормального морфотипа во влагалище, уменьшением роли влагалища как защитного эпитопа, что обусловливает частое рецидивирование восходящей ИМП [2].

Клинический диагноз НИМП в основном базируется на данных анамнеза. Чаще всего женщины предъявляют жалобы на частое, болезненное мочеиспускание, боли в надлобковой области, неприятный запах мочи или наличие мутной мочи, предшествующие инфекции мочевыводящих путей в анамнезе, иррадиацию болей во влагалище, терминальную макрогематурию. Нередко рецидив цистита связывают с половым актом и отмечают развитие симптомов на 2–3-и сутки после коитуса.

Диагностика цистита основывается на клинических симптомах, микроскопии анализа мочи (выявление бактериурии и пиурии) и культуральном исследовании мочи. По данным международных и российских исследований, наиболее частым – 70–80 % случаев – возбудителем бактериального цистита в настоящее время является уропатогенная кишечная палочка [3–5, 9, 10].

Однако, несмотря на довольно широкий выбор антимикробных препаратов, различные схемы антимикробной профилактики рецидивов цистита, фитотерапию, эстрогенотерапию, вакцинотерапию, почему же цистит часто рецидивирует?

Слизистые оболочки служат своего рода механическим барьером, защищающим организм от факторов внешней среды. Несмотря на постоянное воздействие различных патогенов, ткани остаются стерильными и инфекционно-воспалительный процесс развивается достаточно редко у определенной группы пациентов, что, очевидно, зависит от состояния врожденного иммунного ответа слизистых оболочек [5, 6]. Антимикробная защита осуществляется за счет механизмов врожденного иммунитета, микробиоцидных молекул слизистой оболочки (антимикробных пептидов, таких как дефензины, кателицидины, которые являются медиаторами врожденного иммунного ответа) и привлечения клеток воспаления. От уровня продукции антимикробных пептидов зависит эффективность врожденного иммунного ответа на внедрение бактериального агента. β-дефензины делятся на β-дефензины 1 и 2 (Hbd1 и Hbd2 соответственно) и вырабатываются эпителиальными клетками, в том числе и урогенитального тракта. Hbd1 вырабатывается конститутивно в отличие от Hbd2, который продуцируется в ответ на воспаление и/или инфекцию. Особые рецепторы врожденного иммунитета, распознающие различные патогены, экспрессируются на различных клетках иммунной системы, а также на клетках слизистой уретры. Ключевую роль играют так называемые Тоll-подобные рецепторы (Toll-like-receptors — TLR). Именно они распознают патогены и индуцируют в клетках слизистой секрецию цитокинов, интерферонов и противомикробных пептидов, тем самым обеспечивая защиту слизистой оболочки [6–8]. Как изменяется защита слизистой уретры у пациенток с рецидивирующим бактериальным циститом?

Целью работы явилась оценка компонентов врожденного иммунитета на уровне экспрессии генов TLR2, TLR4 и HBD1 в эпителиальных клетках слизистой уретры у женщин с хроническим бактериальным циститом и в группе здоровых женщин.

Материалы и методы. Обследованы две группы женщин. В исследуемую группу были включены 40 пациенток с рецидивирующим бактериальным циститом, средний возраст которых составил 31,45 (19–68) года, длительность заболевания — около 3,3 (1–10) года. В контрольную группу вошли 20 здоровых женщин, возраст которых в среднем составил 37 (24–53) лет.

Двадцать (58,8%) женщин отмечали развитие рецидива цистита после полового акта. Количество рецидивов цистита за год в среднем составило 4 (1–10). Все пациентки неоднократно получали антимикробную терапию, включая все современные рекомендуемые препараты: фосфомицина трометамол, фуразидина калиевую соль с магнием карбонатом основным, норфлоксацин, левофлоксацин, цефиксим, цефтибутен, амоксиклав и др. Для профилактики обострений им периодически назначали фитопрепарат канефрон от 1 до 3 мес, препарат клюквы монурель в течение 1 мес и др. Женщины в климактерическом периоде периодически применяли эстрогенотерапию – влагалищные крем или свечи с эстриолом. Однако после прекращения терапии или профилактических курсов цистит рецидивировал.

По результатам бактериологических анализов мочи в группе исследуемых женщин обнаружены следующие культуры бактерий: E. coli – у 14 (41,18%); смешанная флора (E. coli+Staphylococcus spp; E. faecalis+E. coli) – у 5 (14,7%); E. faecalis – у 2 (5,9%), у 1 (2,9%) пациентки в посеве мочи обнаружены лактобациллы, что можно считать контаминацией при заборе мочи; у 12 пациенток в культуральном анализе мочи роста флоры не выявлено.

Для определения экспрессии генов TLR2, TLR4 и HBD1 соскоб из уретры забирали посредством урогенитального зонда типа «А». Собранный материал помещали в эппендорф («Axygen», США) с наполнителем «Среда-РНК» и после транспортировки в холодном контейнере (при 4°С) хранили при -70°С. Выделение РНК из эпителиальных клеток проводили с использованием комплекта реагентов РИБО-сорб («ИнтерЛабСервис», Россия), предназначенного для выделения РНК из клинического материала. Полученную очищенную РНК собирали в отдельную пробирку и замораживали в холодильнике для последующих исследований при -70°С.

• Синтез кДНК был проведен с помощью реакции обратной транскрипции на матрице мРНК генов TLR2, TLR4 и HBD1 для последующего определения числа копий с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Полученную в ходе реакции кДНК хранили при температуре -70°С.
• В работе была использована модификация ПЦР (ПЦР-РВ), позволяющая определять кинетику реакции и на основе полученных данных судить о наличии и исходном количестве ДНК-мишени в образце. Последовательность праймеров и зондов TLR2, TLR4 и HBD1 подбирали с помощью программы Vector NTI 8.0, анализируя последовательность интересующих генов, полученную из электронной базы данных GenBank. Реакционную смесь готовили с использованием комплекта реагентов для проведения ПЦР-РВ в присутствии интеркалирующего красителя SYBR Green I («Синтол», Россия), согласно рекомендациям фирмы-производителя. После приготовления реакционных смесей, содержащих кДНК, пробирки помещали в прибор ДТ-96 для проведения ПЦР-РВ («ДНК-технология», Россия). Прибор позволяет анализировать образцы ДНК/РНК в динамическом диапазоне от 1 до 109 копий и одновременно детектировать 4 флуоресцентных красителя (FAM/SYBR Green, ROX, R6G, CY5). Амплификацию кДНК проводили в режиме 95°С – 5 мин (94°С – 20 с, 62°С – 40 с) 40 циклов.
• Уровень экспрессии исследуемых генов определяли относительно экспрессии гена β-актина, для определения которой использовали Набор реактивов для обнаружения и определения кДНК β-актина человека («Синтол», РФ).
• Данные по экспрессии исследуемых генов представлены в виде десятичного логарифма от числа копий соответствующего гена относительно 106 копий гена β-актина. Достоверность различий рассчитывали с использованием непараметрического критерия Манна–Уитни (p≤0,05).

Результаты. Уровень экспрессии генов TLR2, TLR4 и HBD-1 в эпителии слизистой уретры в группе здоровых женщин составил 2,93±0,19, 1,29±0,07 и 4,98±0,3 копии гена соответственно. Именно баланс молекул врожденного иммунитета обеспечивает защиту слизистой оболочки уретры в норме. Группа больных хроническим циститом по показателям экспрессии генов молекул врожденного иммунитета была неоднородной. Уровень экспрессии гена TLR2 составил 3,74±0,22 у 80% женщин исследуемой группы, у 20% женщин средние значения по показателю TLR2 составили 2,25±0,22 (p<0,01). Уровень экспрессии гена TLR4 у 80% женщин составил в среднем 1,78±0,29, у 20 % был значительно ниже и составил 0,57±0,24 (p<0,01). В 50 % наблюдений уровень экспрессии гена HBD-1 составил 3,59±0,23, в остальных – 4,52±0,28 (p<0,01). Полученные данные можно объяснить индивидуальными различиями в уровне защиты слизистой уретры больных хроническим циститом. В то же время необходимо отметить, что неоднородность данных, полученных при оценке материала в группе больных женщин, может быть обусловлена и фазой менструального цикла. В начале исследования мы провели забор материала без учета фазы менструального цикла в день обращения пациентки в поликлинику института.

В дальнейшем при анализе предварительных данныхи с учетом фазы менструального цикла были получены различия показателей примерно у 20% пациенток, в связи с чем дальнейший забор материала у женщин мы провели на 10–14-е сутки менструального цикла (в середине цикла). Вероятнее всего, этим и обусловлена разница в полученных результатах, что требует дальнейших исследований.

Обсуждение. Исследование врожденного иммунитета слизистых оболочек урогенитального тракта у женщин с рецидивирующей инфекцией нижних мочевыводящих путей поможет понять причину частых рецидивов бактериального цистита и определить пути поиска новых воздействий медикаментозного и немедикаментозного характера. Объяснить частые рецидивы бактериального цистита только факторами вирулентности и патогенности микроорганизмов, возбудителей мочевой инфекции невозможно, так как уропатогенная кишечная палочка является условным, а не абсолютным патогеном. Очевидно, для развития ответной воспалительной реакции со стороны слизистой оболочки мочевого пузыря должны быть изменения в защитных механизмах либо врожденного, либо приобретенного характера. По данным проведенного исследования, у женщин, страдающих рецидивирующим циститом, по сравнению со здоровыми женщинами выявлена повышенная экспрессия генов Тоll-подобных рецепторов: TLR2, TLR4 и снижение экспрессии генов антимикробного пептида β-дефензина1 - HBD1, вырабатываемого эпителиальными клетками урогенитального тракта. По нашим данным, на экспрессию рецепторов TLR2 и TLR4 и концентрацию противомикробного пептида влияет и гормональный фон женщины (фаза менструального цикла), что было отмечено нами при анализе данных.

Выявление изменений в показателях только трех из многочисленных факторов врожденного иммунного ответа при наличии хронического воспалительного процесса в нижних мочевыводящих путях позволяет предположить несостоятельность врожденного иммунного ответа, следствием которого мог стать переход заболевания из острой в хроническую форму.

Выводы. Выявлен дисбаланс в иммунной защите слизистой уретры, проявляющийся в гиперэкспрессии генов паттерн-распознающих рецепторов TLR2, TLR4 и выраженном снижении уровня экспрессии гена противомикробного пептида HBD1. На экспрессию рецепторов TLR2, TLR4 может влиять фаза менструального цикла: по нашим данным, целесообразнее осуществлять забор клеточного материала у пациентки строго в середине цикла. Значительное увеличение экспрессии TLRs и одновременное снижение экспрессии гена β-дефензина-1 эпителиальными клетками уретры в совокупности могут способствовать «хронизации» воспалительного процесса и более высокой подверженности заболеваниям урогенитального тракта.

Изучение показателей врожденного иммунитета слизистых оболочек мочевыводящих путей женщин с рецидивирующей инфекцией нижних мочевых путей внесет большой вклад в понимание механизмов рецидивирования инфекционно-воспалительного процесса и поможет изменить подходы к комплексной терапии этого трудного для лечения заболевания.