Введение. Онкоурологические заболевания включают злокачественные новообразования различных типов и локализаций, наиболее частые из которых – рак предстательной железы (РПЖ), рак мочевого пузыря (РМП) и рак почки (РП) – входят в десятку наиболее распространенных опухолей у мужского населения России [1]. Лабораторные методы определения молекулярных маркеров этих новообразований в моче или крови в широкую клиническую практику пока не вошли. Вместе с тем накоплена масса данных о молекулярно-генетических нарушениях при РПЖ, РМП и РП, некоторые из которых могут рассматриваться в качестве потенциальных диагностических маркеров [2–4]. Часто при онкоурологиче-
ских заболеваниях опухолевые клетки попадают в просвет мочевыводящих путей в достаточном для анализа количестве, и присутствующие в них генетические изменения могут быть выявлены в ДНК (РНК) из осадка мочи [5, 6]. В настоящем обзоре рассмотрены потенциальные молекулярно-генетические маркеры и подходы к их тестированию в осадке мочи в контексте развития неинвазивной диагностики РПЖ, РМП и РП.

Анализ экспрессии генов в диагностике рака предстательной железы по осадку мочи

К основным методам ранней диагностики РПЖ относят пальцевое ректальное исследование, определение уровня простатспецифичного антигена (ПСА) и трансректальное ультразвуковое исследование, из них ПСА как независимый маркер обладает большей предиктивной ценностью. Простатспецифический антиген – каллекреинподобная сериновая протеаза, продуцируемая исключительно клетками предстательной железы. Это в первую очередь органоспецифичный, но не раково-специфичный маркер: концентрация ПСА может быть повышена при гиперплазии или аденоме предстательной железы. Повышение уровня ПСА, подтвержденное при повторном анализе, может служить показанием к биопсии предстательной железы. Морфологическое исследование новообразований предстательной железы вследствие гетерогенности и мультифокальности опухолей представляет сложную задачу, решение которой требует высокой квалификации патолога. Зачастую доброкачественные гиперпластические железистые структуры соседствуют с фокусами интраэпителиальной неоплазии (ПИН) и аденокарциномой различной степени дифференцировки [7, 8]. Около 15 лет назад методом дифференциального дисплея выявили кДНК гена PCA3 (prostate cancer gene 3, ранее его называли DD3 – differential display clone 3), гиперэкспрессия которого характерна для РПЖ. Продукт гена PCA3 относится к некодирующим РНК, представлен рядом изоформ из-за альтернативного сплайсинга, разных сайтов инициации и терминации транскрипции, локализован внутри интрона 6-го гена PRUNE2, задействованного в регуляции клеточной пролиферации [9]. За последние 5 лет экспрессия гена РСА3 подверглась всестороннему изучению в качестве потенциального маркера РПЖ, в том числе в опухолевых клетках из осадка мочи. Показано, что в аденокарциноме простаты экспрессия РСА3 в 60–70 раз превышает ее уровень в морфологически не измененной ткани [10]. В некоторых работах, посвященных изучению экспрессии РСА3 в осадке мочи, анализ включил получение первой порции мочи (20–30 мл) после массажа простаты, центрифугирование, выделение тотальной РНК из клеточного осадка, обратную транскрипцию и полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в реальном времени с TaqMan-зондами. 
В качестве калибратора выступил ген KLK3, который кодирует ПСА и характеризуется простатспецифичной экспрессией [11]. Однако более эффективный подход лежит в основе метода анализа экспрессии РСА3 в осадке мочи, разработанного компанией «DiagnoCure Inc.» (Канада). В нем РНК, выделенную из осадка мочи после массажа простаты, анализировали с помощью NASBA в реальном времени, где происходит изотермическая амплификация нуклеиновых кислот при участии обратной транскриптазы и Т7-полимеразы, а в качестве зондов используют «молекулярные маячки» (beacons). Дизайн эксперимента также предусматривал одновременную оценку уровней экспрессии целевого гена РСА3 и органоспецифичного контроля – гена KLK3, по представленности транскриптов которого осуществляли нормировку уровня экспрессии РСА3 [12]. В дальнейшем компания «Gene-Probe Inc.» (США) внесла в этот метод ряд модификаций: вместо центрифугирования мочу забирали в среду, где проводили лизис клеток и сорбцию исследуемых мРНК со специфичными олигонуклеотидами, иммобилизованными на магнитных шариках; для оценки результатов амплификации был определен пороговый уровень PCA3-Score (этот показатель равен умноженному на 103 отношению количества копий мРНК PCA3 к количеству копий мРНК KLK3), что привело к созданию диагностического набора Progensa™, предназначенного для количественного определения мРНК гена РСА3 в осадке мочи [13]. К настоящему времени неинвазивную диагностику с использованием набора Progensa™ осуществляют во многих лабораториях, появилась возможность обобщить основные преимущества, недостатки и возможные пути развития указанного метода. Во-первых, ген РСА3 гиперэкспрессируется в опухоли относительно нормальной ткани, а любой онкомаркер, концентрация которого при наличии опухоли превышает его концентрацию в норме на некоторую величину, имеет, как правило, «серую зону» пограничных значений. С этим связана проблема выбора пограничного значения PCA3-Score: общепринятым сейчас считают значение в 35 баллов, хотя ряд авторов придерживаются уровня в 20–25 баллов с целью повышения диагностической чувствительности теста [14, 15]. По данным различных авторов, при PCA3-Score-35 чувствительность метода составляет 52–67%, специфичность – 72–80, диагностическая точность – 70–77% [16–19]. В целом PCA3-тест позволяет избегать до 55% ненужных повторных биопсий с отрицательным результатом [20, 21]. Во-вторых, анализ экспрессии РСА3 в моче не может быть использован для диагностики предопухолевых изменений, например, не выявлено достоверных различий PCA3-Score у пациентов с воспалением, доброкачественной гиперплазией и ПИН высокой степени [22]. В-третьих, высказывают точку зрения, согласно которой для повышения точности диагностики PCA3-Score целесообразно включать в калькуляторы рисков, куда входят и другие данные обследования пациента, например возраст, уровень ПСА, объем простаты, результат пальцевого ректального исследования, индекc phi (prostate health index, учитывающий концентрации свободного и общего ПСА, а также (-2)проПСА) [20, 23]. Следует также сказать, что набор Progensa™ предназначен для оценки уровня экспрессии РСA3 в моче при решении вопроса о целесообразности повторной биопсии у пациентов с подозрением на РПЖ при повышенном уровне ПСА и отрицательном результате первой биопсии. Эта проблема представляется существенной в диагностике заболевания, так как подавляющее большинство повторных биопсий оказывается отрицательным, а проведение еще одной инвазивной процедуры на предстательной железе сопряжено с риском осложнений и дискомфортом для пациента [24]. До недавнего времени речь не шла о замене традиционного теста ПСА или о широком использовании анализа РСА3 при первичной диагностике. Вместе с тем PCA3 охарактеризован как маркер с диагностической точностью выше, чем у общего ПСА и отношения свободного к общему ПСА, особенно в диапазоне концентраций ПСА 2–10 нг/мл [16, 25, 26]. 
В 2013 г. опубликованы результаты обследований более 3000 пациентов, которые показали, что уровень экспрессии PCA3 в моче можно использовать при первичной диагностике как независимый предиктор обнаружения РПЖ [27]. Можно сказать, что анализ экспрессии РСА3 сейчас является одним из наиболее информативных методов в диагностике РПЖ, однако для широкого применения РСА3 как индивидуального маркера РПЖ в диагностике целесообразно увеличивать его диагностическую точность. Это может быть достигнуто при мультиплексном анализе РСА3 вместе с другими генами, экспрессия которых специфична для РПЖ, например TMPRSS2-ERG, KLK2, DLX1 и др. [28]. Из них наиболее полно охарактеризован в качестве диагностического маркера химерный онкоген TMPRSS2-ERG. При РПЖ часто образуются химерные гены, представляющие собой продукт слияния 5’-нетранслируемой области гена TMPRSS2 с генами семейства транскрипционных факторов ETS. В подавляющем большинстве случаев химерный ген представлен TMPRSS2/ERG, который выявляют в 50% случаев РПЖ, при том что в участках доброкачественной гиперплазии и в нормальной ткани органа он отсутствует [29, 30]. Делеция в области 21q22.2-3 с формированием TMPRSS2/ERG высокоспецифична для РПЖ и не встречается в других типах опухолей [31]. Образование TMPRSS2/ERG – раннее событие в канцерогенезе предстательной железы, его идентифицируют в 11% очагов ПИН высокой степени [32]. Результаты проведенных работ свидетельствуют о том, что в осадке мочи целесообразно одновременно определять мРНК генов PCA3 и TMPRSS2/ERG, что позволяет снижать количество ложноотрицательных результатов, практически не увеличивая при этом количество ложноположительных результатов [33, 34]. Разработан набор для количественного определения мРНК TMPRSS2-ERG в моче, в основе которого лежит метод, ранее реализованный в тест-системе Progensa™; в нем рассчитывают Т2-Score, равный умноженному на 105 отношению концентраций мРНК TMPRSS2-ERG к мРНК KLK3 [35]. В ходе многоцентрового исследования показано, что определение PCA3 и TMPRSS2/ERG в комбинации при анализе мочи на РПЖ позволяет увеличивать диагностиче-
скую точность метода до 84% [36].

ДНК-диагностика рака мочевого 
пузыря по осадку мочи

Наиболее распространенной формой РМП служит поверхностный неинвазивный рак, который встречается у 80% больных, у остальных пациентов диагностируют инвазивный рак со свойственными ему множественными делециями районов локализации генов-супрессоров (3р, 5q, 14q, 9q и др.), самая частая из которых – делеция 9р21 с генами-супрессорами ARF, CDKN2A, CDKN2B. Напротив, к характерным чертам поверхностных опухолей относятся активирующие мутации и/или гиперэкспрессия протоонкогенов (FGFR3, ERBB2, HRAS, и др.) [7]. Часто при поверхностном РМП выявляют активирующие мутации FGFR3 в 7-м и 10-м экзонах, которые встречаются в 60% опухолей [37]. Конститутивная активация FGFR3 приводит к стимуляции МАРК-каскада и клеточной пролиферации. По мнению ряда авторов, наличие соматической активирующей мутации FGFR3 ассоциировано с высокодифференцированными опухолями [38]. Кроме выявления первичной опухоли по мутации FGFR3 анализ мутаций этого гена в осадке мочи был успешно применен вместо цистоскопии при регулярном обследовании пациентов после удаления первичной опухоли для выявления рецидива РМП [39]. На ранних стадиях поверхностного РМП выявляют также соматические 
мутации в гене PIK3CA с частотой около 35%. Этот ген кодирует фосфотидилинозитол-3-киназу, которая является частью сигнального пути Akt. Нарушения в PIK3CA представлены активирующими миссенс-мутациями, которые локализуются преимущественно в 9-м и 20-м экзонах [40]. 
В злокачественных опухолях мочевого пузыря, как и во многих других опухолях, наблюдают активность теломеразы – фермента, обеспечивающего удлинение концов теломер при репликации геномной ДНК. В 55% случаев РМП наблюдают соматические мутации в промотере гена теломеразы (TERT), ассоциированные с гиперэкспрессией TERT и активностью теломеразы. Почти все мутации представлены транзициями -124G→A и -146G→A, в единичных случаях встречаются замены в позициях -138 и -139 или трансверсии. Мутации в промотере TERT встречаются с частотой около 50% в опухолях, происходящих из уротелия, в других типах новообразований их частота значительно ниже: 8% – в почечно-клеточных карциномах, 4% – в опухолях надпочечников, не обнаружены при РПЖ [41]. С методической точки зрения мутации в промотере TERT представляют собой удобную мишень для ПЦР-диагностики, так как они могут быть амплифицированы в составе одного ПЦР-продукта. Ряд авторов применили ПЦР с последующим мини-секвенированием для генотипирования мутаций -124G→A и -146G→A по ДНК, выделенной из осадка мочи. Частота мутаций TERT (диагностическая чувствительность) варьировалась от 50 до 80% в зависимости от групп, сформированных по различным клиническим критериям (инвазивный или поверхностный рак, пол, возраст, наличие мутации FGFR3 и др.). Вместе с тем диагностическую специфичность соматических мутаций в промотере TERT оценивают на уровне 73%, что значительно ниже, чем у мутаций FGFR3 (около 90%) [42, 43]. Была продемонстрирована возможность выявления рецидивов РМП по анализу в осадке мочи мутаций TERT, которые ранее были определены в первичных опухолях [44]. Другие гены (например, STAG2 и ESPL1), точковые мутации в которых могут иметь значение для диагностики и встречаются с часто-
той более 10% при РМП, недавно выявлены с помощью полногеномного секвенирования опухолей [45]. В опухолях мочевого пузыря часто наблюдают также микросателлитную нестабильность — появление дополнительных аберрантных аллелей простых тандемных повторов, возникающих вследствие инактивации системы репарации неспаренных оснований ДНК [46]. Аберрантные аллели выявляют при генотипировании STR-маркеров методом мультиплексной ПЦР с мечеными праймерами и последующим фрагментным анализом на капиллярном секвенаторе [47]. При этом предпочтительнее тестировать тетрануклеотидные повторы, меньше подверженные преимущественной амплификации более короткого аллеля и ошибкам полимеразы, чем ди- или тринуклеотидные STR-маркеры. Так, была предложена система из 6 STR-маркеров (D9S252, D9S752, D9S304, D8S1125, D8S1130, G10693), выявившая микросателлитную нестабильность при РМП с аналитической чувствительностью 
63% [48]. Точковые активирующие мутации указанных выше генов и микросателлитная нестабильность, выявляемые на фоне избытка неизмененной ДНК методами, основанными на ПЦР, могут рассматриваться как основа для разработки неинвазивной ДНК-диагностики по осадку мочи при 
РМП.

Метилированные последовательности 
генов-супрессоров как потенциальные 
маркеры в онкоурологии

Рассмотренные ранее маркеры РПЖ и РМП относятся к изменению последовательности ДНК и экспрессионным нарушениям. В настоящее время в онкогенетике получили развитие исследования эпигенетических маркеров – локального гиперметилирования 5’-регуляторных областей в генах-супрессорах. Для практической онкогенетики имеет значение то, что аберрантное гиперметилирование выявлено при всех типах злокачественных новообразований и может быть определено в клинических образцах c помощью метилспецифической ПЦР [7]. Спектр аберрантно метилированных генов при РПЖ, РМП и РП частично перекрывается, однако при каждом из указанных заболеваний имеет свои особенности. Например, метилирование генов-супрессоров RARB2, CDKN2A, RASSF1 обнаружено во многих типах злокачественных новообразований, хотя с более высокой часто-
той встречается в опухолях почки. Наиболее часто при РП подвергается метилированию ген RASSF1 (до 90% случаев), однако аналитическая чувствительность выявления метилирования этого гена сильно зависит от дизайна праймеров для метилспецифической ПЦР у разных авторов, моно- или биаллельного метилирования [49]. Метилирование VHL, напротив, встречается только в наиболее распространенной опухоли почки – светлоклеточной карциноме, но лишь в 8–12% случаев РП [50]. В целом детекцию аберрантного метилирования при РП в осадке мочи различные авторы чаще всего проводили в генах-супрессорах RASSF1, CDH1, RARB2, VHL. При РПЖ аберрантному метилированию наиболее часто подвергаются гены GSTP1, RARB2, RASSF1, PTGS2. 
С частотой более 80% метилирование этих генов встречается в аденокарциноме предстательной железы, реже – в участках интраэпителиальной неоплазии (GSTP1 – 70%, RASSF1 – 64, RARB2 – 20%), крайне редко или отсутствует – в очагах доброкачественной гиперплазии и нормальной ткани. Как и в диагностике РПЖ с помощью экспрессионных маркеров, отдельные гены целесообразно объединять в панель маркеров метилирования [51, 52]. Однако расширение панели генов-супрессоров не увеличивает автоматически эффективность такой панели – при включении трех-четырех генов-супрессоров достигается чувствительность 85–89% при наибольшей специфичности теста, добавление других часто метилируемых генов приводит не только к увеличению чувствительности, но и к существенному снижению специфичности такой панели для РПЖ [53, 54]. Желательно также добавлять в панель те гены, аберрантное гиперметилирование которых не только встречается с высокой частотой, но и высокоспецифично для РПЖ и происходит на ранних этапах развития опухоли, когда уровень ПСА не превышает 4 нг/мл (GSTP1, PTGS2 и LGALS3) [55]. Мета-анализ 22 оригинальных исследований показал, что метилирование GSTP1, выявляемое в моче или плазме крови, обладает большей специфичностью и сопоставимой чувствительностью по сравнению с ПСА [56]. В большинстве работ по РМП перечень анализируемых локусов включал гены-супрессоры, часто метилируемые при злокачественных новообразованиях: RASSF1, ARF, APC и т.д. Тестирование панели аберрантно метилированных генов продемонстрировало чувствительность 87% и специфичность, близкую к 99%, при исследовании осадков мочи [57, 58]. Диагностическую точность генетических исследований представляется перспективным повысить путем совместного определения гиперметилированных генов и других генетических маркеров РМП. Исследование метилирования 11 генов-супрессоров, мутаций FGFR3, PIK3CA, TP53 и генов семейства RAS на материале 113 осадков мочи показало, что комбинация анализа метилирования RASSF1, APC, SFRP2 и мутаций FGFR3 достигает чувствительности 90 и 62% в опухоли и моче соответственно при специфичности, близкой к 98% [59]. Увеличение диагностической точности в среднем на 16% показано и в другом исследовании, в котором анализ метилирования трех генов комбинировали с выявлением соматических мутаций FGFR3 [60]. Анализ метилирования генов-супрессоров пока не нашел широкого применения в онкологии – отчасти вследствие различий в методических подходах при анализе метилирования ДНК, использования разных комбинаций метилированных локусов и как следствие – невысокой воспроизводимости. Тем не менее в перспективе анализ аберрантно метилированных локусов можно будет рассматривать как инструмент в неинвазивной диагностике онкоурологических заболеваний.

Заключение. В настоящее время накоплен большой объем данных о генетических нарушениях, которые могут стать маркерами спорадических опухолей. При онкоурологиче-
ских заболеваниях, как правило, опухолевые клетки присутствуют в осадке мочи, что открывает возможности для неинвазивной молекулярно-генетической диагностики. При РПЖ оптимальными маркерами являются гипер-
экспрессия гена РСА3 и экспрессия химерного онкогена TMPRSS2-ERG. Компания «Gene-Probe Inc.» (США) уже выпустила на рынок набор Progensa™, предназначенный для оценки уровня экспрессии РСA3 в моче при решении вопроса о целесообразности повторной биопсии пациентам с подозрением на РПЖ. Идут работы по интеграции в набор TMPRSS2-ERG, а также клинические испытания тестов на указанные маркеры в качестве методов скрининга и диагностики РПЖ. Показано, что диагностическая точность количественного определения мРНК генов РСА3 и TMPRSS2-ERG выше, чем у теста на ПСА. Для РМП пока не разработаны тест-системы с применением молекулярно-генетических маркеров. Вместе с тем комбинированный анализ соматических мутаций в генах FGFR3, PIK3CA, TERT и микросателлитной нестабильности может быть основой для разработки диагностических тест-систем с чувствительностью и специфичностью выше, чем у применяемых сейчас лабораторных методов диагностики РМП. Метилирование генов-супрессоров также может рассматриваться как потенциальный маркер для диагностики онкоурологических заболеваний после стандартизации панелей исследуемых локусов, методов бисульфитной конверсии, дизайна праймеров и зондов для метилспецифической ПЦР. Все наиболее частые точковые мутации при РП, РПЖ и РМП, известные к настоящему времени, были определены в том числе с использованием технологий высокопроизводительного секвенирования следующего поколения. Уже производятся или могут быть разработаны в ближайшем будущем тест-системы для молекулярно-генетической диагностики онкоурологических заболеваний по осадку мочи.