Ежегодно в мире регистрируют более 330 тыс. случаев рака мочевого пузыря (РМП), представляющего собой актуальную проблему современной онкологии [1]. В основе развития РМП лежат разнообразные молекулярно-генетические нарушения в соматических клетках: точковые мутации, протяженные делеции (потеря гетерозиготности) в областях локализации генов-супрессоров, амплификация онкогенов, аберрантное метилирование ДНК, изменения паттерна экспрессии регуляторных РНК и большого количества структурных генов. Из всего перечисленного выше точковые мутации обладают наибольшей потенциальной ценностью как диагностические маркеры, поскольку они служат частым событием канцерогенеза, характеризуют инициацию и дальнейшую клональную эволюцию злокачественной опухоли, представляют собой изменение ДНК, выявляемое рутинными молекулярно-генетическими методами. В первую очередь представляют интерес те генетические изменения, на основе которых можно диагностировать РМП по клеткам в осадке мочи (в том числе рецидивы заболевания), выделять прогностические группы пациентов и придерживаться разной тактики наблюдения после удаления первичной опухоли. Если обратиться к классификации РМП по клиническим признакам, то 90% случаев РМП представлены уротелиальной карциномой, у 80% пациентов наблюдают поверхностные и у 20% – мышечно-инвазивные опухоли, отдельную группу составляет карцинома in situ (CIS), которая характеризуется высоким риском прогрессирования и встречается в качестве фонового изменения у 50% пациентов с мышечно-инвазивным РМП [2]. За различиями в морфологической классификации, стадировании и прогнозе РМП стоят разные паттерны мутаций. Например, для инвазивного рака характерны множественные делеции районов локализации генов-супрессоров (3р, 5q, 14q, 9q и др.), самой частой из которых является делеция 9р21 с генами-супрессорами ARF, CDKN2A, CDKN2B, и он развивается через стадию CIS. Напротив, к характерным чертам поверхностных опухолей относятся активирующие мутации и гиперэкспрессия протоонкогенов (FGFR3, ERBB2, HRAS и др.), поверхностный РМП развивается через стадию гиперплазии, часто бывает мультифокальным и рецидивирующим [3, 4]. Проведенные полногеномные исследования существенно дополнили данные о механизмах развития поверхностного и инвазивного РМП, выявили новые мутации-драйверы, способствующие рецидиву поверхностного рака, а также его переходу в инвазивный РМП и последующему метастазированию [5]. В настоящем обзоре систематизированы сведения об основных мутациях в канцерогенезе РМП, их роли в прогрессировании первичной опухоли, метастазировании и значении как мишеней для диагностики и таргетной терапии.

Локализация наиболее частых точковых мутаций при РМП

В настоящее время идентифицированы сотни мутаций и десятки протоонкогенов и генов-супрессоров, задействованных в канцерогенезе РМП. Среди этого многообразия генетических нарушений можно выделить точковые мутации, в основном однонуклеотидные замены, которые встречаются с высокой частотой (более 10%) в первичных опухолях, локализованы в «горячих точках» мутагенеза нескольких ключевых онкогенов и рассматриваются как потенциальные диагностические маркеры РМП.

Мутации в гене FGFR3. Ген FGFR3 локализован в области 4р16.3, содержит 19 экзонов, из которых в образовании полноразмерного транскрипта участвуют экзоны 2–18 [6]. По различным данным, от 50 до 80% первичного уротелиального рака при поверхностном РМП несут мутации FGFR3, тогда как в инвазивных опухолях и их метастазах эта частота составляет около 10% [5, 7]. Ген FGFR3 принадлежит к семейству генов трансмембранных рецепторов FGFR1-4, которые кодируют гликопротеины – рецепторы фактора роста фибробластов (FGF). После связывания с лигандом рецептор димеризуется и активирует тирозинкиназный домен. FGFR3 задействован в PIK3CA/AKT1-сигнальном пути. Почти все описанные миссенс-мутации находятся между Ig-подобными доменами или в трансмембранном домене, способствуя прочной димеризации и конститутивной активации FGFR3 по механизму образования дисульфидных мостиков или иных прочных взаимодействий. Локализация «горячих точек» – экзон 7 (кодоны 248 и 249) и экзон 10 (кодоны 373 и 375) [5, 8–10]. Применение тест-систем для выявления мутаций FGFR3 методом ПЦР в реальном времени или ПЦР с последующим мини-секвенированием показало целесообразность использования соматических мутаций этого гена как маркеров РМП в первичной диагностике заболевания [10, 11]. Определение специфичных для поверхностного РМП мутаций актуально не только при диагностике первичного РМП, но и даже в большей степени при мониторинге рецидива опухоли. После удаления первичного поверхностного рака необходимо регулярно проводить цистоскопию, так как в 70% случаев в последующем развивается рецидив РМП [12]. Однако проведение цистоскопии сопряжено со значительным дискомфортом для пациента и результаты анализа соматических мутаций в осадке мочи, аналитическая чувствительность которого достигает 80%, могли бы служить критерием отбора пациентов для проведения этой диагностической процедуры [13]. Проблему низкого содержания мутантных аллелей FGFR3 на фоне избытка нормальной ДНК при мониторинге рецидива РМП пытались решить с помощью глубокого таргетного ресеквенирования на одной из платформ секвенирования следующего поколения (NGS – next generation sequencing). Этот метод позволил выявить мутации FGFR3 при доле мутантных аллелей, равной 0,02%. Однако в этом случае возникает вопрос о клинической значимости мутаций – во-первых, соматические мутации FGFR3 могут возникнуть еще на стадии предраковых изменений до морфологически сформированной опухоли), во-вторых, конкордантность результатов поиска мутаций в осадке мочи и первичной опухоли у одного и того же пациента составляет около 90% [14]. По данным мета-анализа и обзоров, активирующие точковые мутации FGFR3 ассоциированы с поверхностным РМП, ранней стадией заболевания, высоко- и умереннодифференцированной уротелиальной карциномой, относительно благоприятным прогнозом при оценке выживаемости пациентов с РМП [9, 10].

Мутации в гене PIK3CA. Миссенс-мутации PIK3CA встречаются в 15–25% случаев поверхностного РМП и значительно реже при инвазивном РМП. Они локализуются преимущественно в спиральном домене (Е542К и Е545К) и киназном домене (Н1047R). Зачастую мутации сопряжены с потерей гетерозиготности (LOH – loss of heterozygosity, или аллельными делециями) гена PTEN, продукт которого ингибирует сигнальный путь PIK3CA/AKT. Хотя мутации в указанных доменах обладают сходным трансформирующим эффектом в клеточных линиях, отношение частоты мутаций в киназном и спиральном доменах варьируется в зависимости от типа опухоли: от 0,29 в РМП до 2 в раке эндометрия, что указывает на возможные различия в механизмах активации сигнального пути PIK3CA/AKT [15]. В опухолях других типов преобладают мутации Е542К и Е545К, тогда как в уротелиальной карциноме чаще встречаются мутации в киназном домене [16]. Мутации FGFR3 и PIK3CA происходят независимо друг от друга, и около 20% случаев поверхностного РМП с мутациями хотя бы в одном из этих генов несут их сочетание. Предполагают, что мутации FGFR3 и PIK3CA в одной опухолевой клетке могут потенциировать действие друг друга [10].

Мутации в гене TERT. Аберрантная реактивация гена теломеразы TERT наблюдается в 90% злокачественных новообразований, помогая опухолевым клеткам преодолевать лимит делений, обусловленный критическим укорочением длины теломерных повторов на концах хромосом. В уротелиальной карциноме описаны мутации в позициях -124G/A и -146G/A от инициирующего кодона ATG, которые приводят к возникновению новых сайтов связывания транскрипционных факторов семейства ETS и многократному усилению экспрессии гена TERT [17]. Мутации в промоторе TERT рассматривают как инициирующие мутации-драйверы, они встречаются на ранних этапах развития РМП. Частота мутаций TERT составляет около 70% в первичных опухолях, что делает их перспективной мишенью для диагностики наравне с мутациями FGFR3. Мутация -124G/A является наиболее частой (40–60 % случаев), затем следует мутация -146G/A (10–13% случаев), в единичных образцах РМП встречаются мутации в близлежащих нуклеотидах или в тех же, но с заменой гуанина не на аденин, а на другой нуклеотид предположительно с тем же канцерогенным эффектом: -124G/Т, -138G/А, -141С/А и некоторые другие [18–20]. В осадке мочи чувствительность выявления мутаций TERT варьируется в пределах 50–60%, что несколько выше, чем у мутаций FGFR3. Однако специфичность мутаций в промоторе TERT существенно меньше, чем у мутаций FGFR3: 89% при сравнении со здоровым контролем и 74% при определении рецидива РМП [21]. К тому же эти мутации происходят примерно с той же частотой уже на стадии предраковых изменений – гиперплазии и дисплазии, что позволяет рассматривать их как ранние скрининговые маркеры, но делает невозможным диагностику РМП по осадку мочи только на основании мутаций TERT [22]. В связи с этим мутации FGFR3, PIK3CA и TERT целесообразно объединить в одну систему маркеров – точковых соматических мутаций, возникающих в РМП, в том числе в рецидивирующих опухолях.

Полногеномные исследования и схемы развития РМП

Механизмы развития РМП и прогностические критерии, основанные на молекулярно-генетических характеристиках опухоли, стали интенсивно изучать с появлением методов NGS. Накопленные данные о генетических нарушениях при РМП позволили составить схему патогенеза РМП на молекулярном уровне и описать процессы, приводящие к инвазивному и поверхностному РМП (см. рисунок). Эти два типа РМП помимо выраженных различий в течении и прогнозе заболевания также имеют принципиальные различия в патогенезе на молекулярном уровне. Поверхностный РМП развивается на участке поля канцеризации, в том числе и как мультифокальная опухоль, при этом ему предшествует гиперплазия уротелия. Уже на стадии гиперплазии происходят мутации в онкогенах FGFR3 и HRAS, делеции в районе 9q (причем мутации FGFR3 и семейства генов RAS происходят независимо друг от друга). Затем приобретаются дополнительные нарушения (мутации PIK3CA, STAG2 и другие), что приводит к образованию поверхностного РМП. Напротив, предраковые изменения инвазивного РМП включают стадию дисплазии с мутациями ТР53, амплификацией E2F3, крупными аберрациями хромосомы 9 в отсутствие активирующих мутаций в FGFR3 и HRAS, затем стадию CIS с инактивацией RB1. После этого на месте CIS развивается инвазивный рак с большим количеством дополнительных аберраций (делеции PTEN и FHIT, потери 2q, 8p, 11q, увеличение количества копий 20q и др.). Практически не встречается сочетаний описанных двух паттернов генетических нарушений; в частности, показана выраженная отрицательная корреляция между мутациями ТР53 и FGFR3, HRAS. Частично паттерн мутаций и аллельных делеций при формировании инвазивного РМП (делеции TP53, RB1) совпадает с профилем мутаций при переходе рецидива поверхностного РМП в инвазивный рак и образовании метастазов, однако метастазирование сопряжено и с другими геномными изменениями [3, 5, 6, 23, 24]. Основные вехи двух описанных патогенетических путей были изучены еще до развития NGS-технологий, однако лишь в последние годы в ходе реализации проектов с применением NGS стало ясно, что множественным хромосомным аберрациям при инвазивном РМП предшествуют точковые мутации в генах, влияющих на сегрегацию хроматид в митозе (STAG1/2 – гены когезина, а также гены ESPL1, SMC1-3), на структуру хроматина (KDM6A, MLL2, ARID1A – каждый из них мутирует в 20–30% случаев инвазивного РМП) [5]. Высокая частота мутаций в генах, участвующих в ремоделинге хроматина, показана и в других исследованиях – мутации в гене деметилазы гистонов UTX встречаются в 21% случаев РМП, ARID1A1, CREBBP и EP300 – в 13%, NCOR1, CHD6, MLL – в 5% [24]. Вероятно, вследствие этих мутаций растет риск неправильного расхождения хроматид, нарушений в механизме гомологичной рекомбинации при репарации двухцепочных разрывов ДНК и как следствие – возникают множественные внутренние делеции и несбалансированные перестройки. Совокупность генетических нарушений в инвазивном РМП можно охарактеризовать как хромотрипсис – одномоментное образование множественных сложных хромосомных перестроек в ходе негомологичной рекомбинации. Наиболее часто делеции затрагивают хромосому 9 и приводят к утрате генов-супрессоров CDKN2A и CDKN2B (9p21), PTCH1 (9q22), TSC1 (9q34), BRINP1 (9q33), а также участки хромосом 2q, 5q, 8р и др. [5, 25, 26]. Подобные явления описаны при мутациях ARID1A1 при карциноме яичников, а точковые инактивирующие мутации PBRM1 (этот ген участвует в поддержании нормальной упаковки хроматина) являются вторыми по частоте после мутаций VHL мутациями-драйверами, лежащими в начале филогенетического дерева развития светлоклеточной карциномы почки [23]. С целью изучения генетических особенностей перехода поверхностного РМП и его рецидивов в инвазивные опухоли были секвенированы основные онкогены и гены-супрессоры в мультифокальных уротелиальных карциномах, имеющих как поверхностные, так и инвазивные структуры. Показано, что такой переход сопровождается приобретением характерных черт CIS и инвазивного РМП: биаллельных делеций CDKN2A, LOH участков хромосомы 9, мутаций ТР53. В изученных мультифокальных опухолях инвазивный и неинвазивный компоненты имели общие мутации-драйверы в генах ремоделинга хроматина ARID1A, MLL2, гена репарации MLH1, генов-кандидатов поверхностной уротелиальной карциномы HRAS, PIK3CA, FGFR3, что указывает на их происхождение из общего клона поверхностного РМП. Кроме того, в поверхностных опухолях показаны мутация и гиперэкспрессия гена ERBB2. В этом исследовании были выявлены и другие редкие точковые мутации, различающиеся в инвазивном и неинвазивном компонентах РМП. Однако, во-первых, авторами было применено таргетное ресеквенирование 409 генов, входящих в панель CCP (Applied Biosystems), методом полупроводникового секвенирования на Ion PGM (для полного профилирования соматических мутаций целесообразно применять глубокое секвенирование экзома на платформе Illumina) [27]. Во-вторых, был использован архивный материал в парафиновых блоках. На результаты NGS могут оказывать влияние особенности фиксации ткани для гистологического анализа. Имеются данные о том, что при высокой конкордантности профилирования соматических мутаций в образцах свежезамороженной опухоли и соответствующих ей парафиновых блоках после 3 лет хранения различия в экспериментальных данных экзомного секвенирования ДНК и секвенирования транскриптома могут достигать 20% [28]. В низкодифференцированном мультифокальном РМП даже при относительно низкой частоте встречаемости в нем мутаций FGFR3 участки папиллярного экзофитного роста несут эти мутации, что еще раз подчеркивает роль FGFR3 как гена-кандидата поверхностного РМП [29]. Интересно отметить, что около 5% уротелиальных карцином при РМП составляют микропапиллярные уротелиальные карциномы – высокозлокачественные опухоли с неблагоприятным прогнозом. Таргетное ресеквенирование 182 генов на платформе Illumina показало, что мутации в экстрацеллюлярном домене ERBB2 несут 40% микропапиллярных уротелиальных карцином, тогда как в «обычных» уротелиальных карциномах мутации ERBB2 были обнаружены лишь в 9% случаев. В микропапиллярных опухолях точковые мутации были представлены миссенс-мутациями S310F, S310Y, R157W, при этом не было отмечено случаев амплификации и/или гиперэкспрессии ERBB2 (напротив, в уротелиальных карциномах около 6% случаев несут амплификацию гена ERBB2 и значительно большее количество опухолей гиперэкспрессируют рецептор ERBB2) [30].

Клональная эволюция уротелиальных карцином при РМП и мутации с прогностическим значением

Предложенная в предыдущем разделе схема объясняет развитие поверхностного и инвазивного РМП посредством двух различных механизмов и представляют яркую иллюстрацию клинической гетерогенности онкологического заболевания, обусловленной генетической гетерогенностью. Тем не менее среди указанных двух типов РМП существуют подгруппы с разным прогнозом, которые сложно обосновать лишь с помощью схемы приобретения частых мутаций. Большей предиктивной ценностью в этом случае обладают экспрессионные профили, хотя комбинации генов как классификаторы РМП существенно разнятся в зависимости от дизайна эксперимента и его методических особенностей. Так, в одном исследовании было выделено 4 кластера образцов, в другом – базальный и люминальный подтипы, в третьем – базальный, люминальный и р53-подобный, также описана классификация на подтипы UroA, UroB, рак с геномной нестабильностью (GU), инфильтрирующий рак и опухоль, подобную сквамозной карциноме (SCCL) [5]. На основе указанных классификаций можно прогнозировать, например, резистентность к цисплатину у р53-подобного РМП. Что касается изучения клональной эволюции РМП, то наиболее информативными представляются NGS-исследования. Так, проведено полногеномное секвенирование 14 образцов РМП, которое показало наличие субклонов в первичной опухоли. В качестве мутаций-драйверов фигурировали точковые мутации в генах FGFR3, TP53, CDKN2A, RYR2, B3GNT9, PIEZO2, FAT1, TSC1, FMN1, амплификация гена MDM2. Как и в ряде других NGS-исследований РМП, показано большое значение мутаций-драйверов в генах, влияющих на структуру хроматина (ARID1A, MLL2, KDM6A, STAG2), особенно в опухолях с FGFR3 «дикого типа» [31, 32]. Особой прогностической ценностью обладают маркеры, которые могут помочь уточнить прогноз при пограничных стадиях заболевания (Т) и степенях дифференцировки опухоли (G) с учетом уже имеющейся клинической классификации и одобренных протоколов лечения, например, случаи РМП ранней стадии Т1 низкодифференцированных опухолей G3 (Т1G3). С помощью сравнительной геномной гибридизации на микрочипах показано, что опухоли Т1G3 представляют собой гетерогенную группу, которую можно разделить на 4 прогностических кластера по возрастанию степени злокачественности: I – мутации FGFR3, отдельные участки LOH 17р и 9р без хромотрипсиса, II – амплификация участков 1q, 7 и 15 хромосом, III – мутации ТР53 (19% на стадии Т1а и более 50% – на поздних стадиях), отсутствие мутаций FGFR3, хромотрипсис (но с относительно низкой частотой потери хромосомы 9), IV – ярко выраженный хромотрипсис. В целом метастазирующий РМП ассоциирован с делециями 10q (LOH в области локализации гена-супрессора PTEN), 16q и 22q, амплификациями 10p, 1q, 12p и 19 хромосом [33, 34].

Наиболее активным в метастатической уротелиальной карциноме представляется сигнальный путь PIK3CA/AKT1/mTOR, который может быть подавлен ингибиторами mTOR (эверолимус, темсиролимус, ингибитор AKT – МК2206). Также для 6–10% таких опухолей характерна активация HER2 вследствие амплификации гена ERBB2, ингибиторы которого (трастузумаб, пертузумаб, лапатиниб) уже используются при лечении других онкологических заболеваний. В отдельных случаях могут оказаться полезными ингибиторы FGFR3 (пазопаниб) и FGFR1 (патопаниб) [35, 36]. Экспериментальный препарат МК-2206 направленно ингибирует PIK3CA с миссенс-мутациями в спиральном домене, он рассматривается как потенциальный препарат для лечения тех поверхностных РМП, в том числе и рецидивов, которые характеризуются мутациями Е542К и Е545К [37].

Интересно, что при обработке ингибиторами FGFR1-3 линий опухолевых клеток РМП в них в ходе клональной эволюции могут возникать мутации, обеспечивающие резистентность к тому или иному ингибитору. Например, резистентность к ингибитору AZ12908010 возникает в опухолях с уже имеющейся мутацией FGFR3 Y373C при появлении второй мутации V555M в том же гене. Механизм действия вторичных мутаций отличен от активирующих мутаций в 7-м и 10-м экзонах FGFR3, он связан с изменением структуры АТР-связывающего кармана рецептора и нарушением связывания с низкомолекулярным синтетическим ингибитором (ключевые аминокислотные остатки 561, 564 и 555 в полипептидах FGFR1–3 соответственно) [38]. Роль FGFR3 в развитии РМП довольно полно изучена к настоящему времени, поэтому он привлекает наибольшее внимание как мишень для таргетной терапии: разработаны антитела к нормальному и мутантному рецепторам (PRO-001, R3Mab), малые синтетические ингибиторы: TKI258 (довитиниб, «Новартис»), AZD4547 («Астра-Зенека»), PD173074 («Пфайзер»), ВМС-582664 (бриватиниб, «Бристоль Майерс») и другие агенты, которые могут быть полезными не только в лечении РМП, но и при миеломе, солидных опухолях, в которых FGFR3 также является одним из ключевых онкогенов [10, 39]. Возможно, скоро таргетная терапия будет использоваться в сопоставимой с химиотерапией долей случаев при РМП, как это уже произошло в лечении светлоклеточного рака почки и колоректального рака.

Исследования последних десяти лет с применением методов NGS показали, что первичные опухоли РМП могут развиваться по двум взаимоисключающим механизмам и ведущая роль в них принадлежит точковым мутациям. Для практической медицины результаты геномных исследований имеют большое значение. Во-первых, определены гены, точковые мутации в которых происходят при РМП наиболее часто. С учетом современных возможностей анализа точковых соматических мутаций в гетерогенном материале это открывает перспективу разработки тест-систем для диагностики РМП по ДНК из осадка мочи. Кроме того, данные о мутациях-драйверах могут помочь обоснованно подойти к назначению таргетных препаратов. Возможно, в недалеком будущем удастся существенно модернизировать и сделать более эффективной диагностику и лечение РМП с учетом мутационного профиля опухоли на разных стадиях заболевания.