Введение. Разработка новых подходов к лечению неинвазивного рака мочевого пузыря (НРМП) остается актуальной проблемой в связи с высокой частотой рецидивов (до 80%) и склонностью к прогрессированию заболевания до 20% [1]. После проведения основного лечения – трансуретральной резекции (ТУР) – почти у 50% пациентов рецидив развивается в первые 2 года. Основные причины такого высокого показателя – диффузный характер неопластических изменений уротелия, наличие рака in situ (CIS), возможность имплантации опухолевых клеток во время операции. Для снижения рецидивирования НРМП широко применяется адъювантная внутрипузырная химиотерапия (ВПХТ) [2]. К числу наиболее перспективных препаратов относится гемцитабин (гемзар), который нарушает метаболизм опухолевых клеток и приводит к их гибели, проявляя умеренную токсичность в отношении нормальных тканей мочевого пузыря [3]. По эффективности профилактирования рецидивов НРМП гемцитабин сопоставим с иммунотерапией БЦЖ. Однако, несмотря на улучшение клинических показателей частоты и сроков развития рецидивов НРМП, проблема излечения остается до конца не решенной.

Поиски в направлении повышения контактного внутрипузырного взаимодействия химиопрепаратов с опухолью при НРМП привели к использованию физических факторов с высокочастотной энергией нагрева [4], а также нетепловыми эффектами электромагнитных когерентных излучений оптического диапазона частот – лазера [5]. Как при соно-, так и при фотодинамической терапии эффекты взаимодействия цитостатиков с опухолевыми клетками связаны прежде всего с клеточными мембранами, увеличением десмосомальных промежутков, обеспечивающих транспорт препарата [5]. На модели саркомы 45 in vitro и in vivo показано, что воздействие слабого сверхнизкочастотного сканирующего магнитного поля (сканирующего МП) значительно повышает эффективность проникновения вглубь опухолевых клеток цисплатина и доксорубицина. Критерием послужило достоверное изменение мембранного потенциала опухолевых клеток с увеличением в 4 раза интенсивности свечения потенциалзависимого флуоресцентного зонда [6, 7]. Действительно, взаимодействие электромагнитного поля и любого проникающего иона (или заряженной молекулы) с клеткой определяется прежде всего величиной мембранных электрических потенциалов на плазматической, митохондриальной и ядерной мембранах [8].

Таким образом, клинический смысл повышения биодоступности цитостатиков в опухолевые клетки при НРМП приобретает биофизическое обоснование благодаря расширению спектра эффективных электромагнитных воздействий, обеспечивающих регуляторную роль мембранного потенциала с учетом его влияния на процессы пролиферации дифференцировки, миграции, поляризации, частоты деления клеток [9–11].

Целью работы стало снижения рецидивирования НРМП путем увеличения эффективности адъювантной ВПХТ с помощью применения сканирующих магнитных полей в условиях in vitro и in vivo.

Материал и методы. Исследования in vitro проведены на 36 образцах ткани опухоли, полученных после проведения ТУР больным НРМП. В каждом конкретном случае получено добровольное согласие больных на использование ткани в научных исследованиях. Из кусочка опухоли готовили препарат для микроскопирования, для чего на предметные стекла в каплю 100 мкл раствора Хенкса осторожно микрошпателем выдавливали клетки. Клеточную взвесь каждого образца опухоли делили на 6 частей, половина из которых витально окрашивали липофильным флуоресцентным зондом катионом ДСМ (4-(n-диметил-аминостирил)-1-метилпиридиний) в концентрации 20 мкМ и инкубировали при температуре 22–25°С в разных вариантах: 1 – с гемцитабином, 2 – после воздействия на клеточную взвесь гемцитабина и сканирующего МП, 3 – без воздействий (фон). Аналогичный алгоритм был применен при витальном окрашивании зондом анионом АНС (1-анилино-нафталин-8-сульфонат в концентрации 40 мкМ. Препараты живых клеток исследовали под люминесцентным микроскопом AxioImager. M2 Zeiss. Микросъемка осуществлена цифровой камерой AxioCamHRC, измерения – с помощью программного обеспечения AxioVision, rel.4.8 – с помощью инструмента Outline. Объем измерений включал от 100 до 400 клеток опухоли в каждой пробе с длиной волны возбуждения ДСМ 480 нм, с волной эмиссии 520 нм, для АНС эти параметры составили 375 и 450 нм соответственно.

В исследование in vivo включены 60 больных НРМП, которые после ТУР и гистологической верификации уротелиального рака вошли в группу промежуточного риска развития рецидива заболевания. Все пациенты получали адъювантную ВПХТ через уретральный катетер 2000 мг растворенного в 50 мл физиологического раствора гемцитабина (в концентрации 40 мг/мл), одно введение в неделю, всего шесть введений.

В основной группе больных (n=30) одновременно с ВПХТ воздействовали на область проекции мочевого пузыря сканирующим МП индукцией 10 мТл со сканированием частоты сигнала от 1 до 150 Гц, экспозицией 10 мин. Генератором электромагнитного сигнала служил отечественный магнитотерапевтический прибор «Градиент-4М» со встроенной микропроцессорной техникой. Между парными индукторами сканирующего МП устанавливали индуктор, создающий постоянное магнитное поле (ПМП) 20 мТл. После окончания процедуры пациент продолжал экспозицию подвергнутого воздействию магнитного поля раствора химиопрепарата, лежа на спине, животе, левом и правом боку по 15 мин, всего – 60 мин.

Каждые три месяца после хирургического лечения проводилось комплексное обследование, включая УЗИ органов брюшной полости и малого таза, цитологическое исследование мочи, при необходимости КТ органов малого таза и цистоскопию для выявления признаков рецидива и прогрессирования заболевания. Результаты оценивали методами вариационной статистики с обработкой в Excel и программе Statistika 6.0. Для оценки уровня значимости различий использовали Т-критерий Стьюдента и непараметрический U-критерий Манна–Уитни.

Результаты и обсуждение. Средняя яркость флуоресценции опухолевых клеток, витально окрашенных флуоресцентным зондом – анионом АНС – в условиях инкубирования с гемцитабином увеличилась на 30%, что свидетельствовало о проникновении противоопухолевого препарата вглубь клеток НРМП. О влиянии химиопрепарата также свидетельствовало значительное количество разрушенных клеток с характерными для АНС затемненными ядрами. Применение в этих условиях воздействия сканирующего МП существенным образом повысило интенсивность свечения клеток опухоли: относительно фона (без воздействия) показатели увеличились в 2,4 раза, относительно гемцитабина – в 1,8 (см. таблицу).

В опытных образцах взвеси опухолевых клеток НРМП можно было оценить эффект сочетанного воздействия гемцитабина и сканирующего МП по массовой клеточной деструкции, регистрируемой визуально в полях зрения. На рисунке (А, Б, В) показаны поля зрения с клетками НРМП, окрашенными ДСМ. В них можно видеть зеленую цитоплазму, желто-бурые ядра. Имела место неоднородность клеток по интенсивности свечения. Сопоставляя показатели средней интенсивности свечения клеток опухоли, связавших ДСМ, можно видеть, что минимальные значения наблюдаются в исходном состоянии – без воздействия. По сравнению с фоном флуоресценция клеток при добавлении в взвесь гемцитабина повышается на 36%, а при сочетании гемцитабина со сканирующим МП разница с фоном достигает 136,4%, т.е. интенсивность свечения увеличивается в 2,4 раза. При этом уровень различий между показателями флуоресценции при моно- (гемцитабин) и сочетанном воздействии (гемцитабин+сканирующее МП) достоверно повышается в пользу последнего, достигая величины, превосходящей в 1,7 раза (см. таблицу). В итоге в среднем накопление противоопухолевого препарата в клетках омагниченной опухоли по окрашиванию как АНС, так и ДСМ одинаково увеличивается, демонстрируя эффект повышения проницаемости мембраны для полярной липофильной молекулы гемцитабина под воздействием сканирующего МП, что подтверждают расчеты отношения интенсивности свечения без воздействия к воздействию на опухолевые клетки Inie/In=0,42.

Анализ результатов лечения больных НРМП показал, что при использовании ВПХТ, модифицированной сканирующим МП в сочетании с ПМП, не зарегистрировано возникновения выраженных побочных эффектов, которые могли бы приводить к отмене терапии. Общее состояние больных было удовлетворительным, гемодинамика стабильна, диурез адекватный. В основной группе только в одном случае было выявлено незначительное снижение лейкоцитов – до 3,2х109, а также в одном случае наблюдался выраженный болевой синдром, купированный ненаркотическими анальгетиками и спазмолитиками. Дизурия, которая, по данным литературы, является наиболее частым проявлением местного эффекта и развивается при ВПХТ гемцитабином с частотой от 10 до 40% [3], в данном исследовании встречалась у 12% пациентов контрольной группы и у 6% – основной, не выходя за рамки I степени токсичности.

При сопоставлении показателей безрецидивного течения было установлено, что появление рецидивов в сроки от 6 до 7 месяцев у больных с ВПХТ гемцитабином при стандартной дозе и схеме введения наблюдалось в 9% случаев. На период 9 мес от момента проведения лечения у больных контрольной группы было отмечено рецидивирование еще в 6% случаев, что в целом составило 15%. В основной группе при регулярном комплексном обследовании, включая УЗИ и цитологическое исследование мочи больных НРМП, получивших ВПХТ в сочетании со сканирующим МП и ПМП, признаков рецидива и прогрессирования заболевания не выявлено ни в одном случае на протяжении 17 мес.

Заключение. Определение больным НРМП лечебной тактики адъювантной ВПХТ гемцитабином значительно увеличивает вероятность безрецидивного течения как по частоте (85%), так и по срокам противоопухолевого эффекта. Однако первые негативные признаки рецидивирования могут манифестировать уже начиная с полугода после ТУР и ВПХТ и в более поздние сроки, что может приводить к прогрессированию опухолевого процесса и потребует иной тактики лечения: расширения хирургического вмешательства, системной химиотерапии, что не только снизит качество жизни пациентов, но и сократит ее продолжительность.

Разработанная модификация ВПХТ гемцитабином путем одновременного воздействия сканирующего МП и ПМП на область проекции мочевого пузыря представляет перспективу в отношении предотвращения раннего рецидивирования и достижения 100%-ного безрецидивного эффекта на протяжении 1,5 года. Сопоставив сроки раннего выявления рецидивов при монотерапии гемцитабином с полученными результатами сочетанного лечения, можно отметить увеличение протяженности безрецидивного периода в 2,8 раза, что свидетельствует о важной роли используемого физического фактора в повышении эффективности адъювантной химиотерапии НРМП. Очевидно, что результативность взаимодействия лекарственного препарата с опухолью во многом определяется активацией биофизических механизмов действия сканирующего МП на клеточные мембраны и повышением проникновения химиопрепарата вглубь опухолевой клетки.

С учетом ключевой роли мембранного потенциала в процессах жизнедеятельности электрически неоднородных клеточных систем опухоли могут быть перспективными разработки сопровождающей противоопухолевой терапии рака мочевого пузыря с помощью волновых технологий.

Проведение больным НРМП адъювантной ВПХТ гемцитабином в сопровождении воздействия сканирующего МП и ПМП обладает хорошей переносимостью, отсутствием выраженных системных побочных реакций, снижением дизурии в 2 раза, повышением эффективности терапии, демонстрируя увеличение сроков безрецидивного течения для 100% пациентов до 17 мес.