Введение. Несмотря на значимые успехи в пренатальной и ранней диагностике пузырно-мочеточникового рефлюкса (ПМР), внедрение новых высокотехнологичных малоинвазивных методов ликвидации рефлюкса, до настоящего времени остаются открытыми вопросы ранней диагностики и прогнозирования течения нефросклероза на фоне данного заболевания.

Выявление признаков склероза почечной паренхимы на ранних стадиях позволит более рационально
подходить к вопросу ренопротективной терапии и тем самым замедлять или предотвращать дальнейшее прогрессирование склеротического процесса в почке, а также открывать новые направления и возможности лечения больных с врожденными анатомическими и функциональными нарушениями в мочевыводящих путях (МВП).

Традиционные клинические, лабораторные и инструментальные методы определения степени повреждения почечной паренхимы не всегда информативны, так как позволяют выявлять лишь поздние этапы склеротического процесса в почках [2, 3]. В последнее десятилетие все больший интерес исследователей вызывают малоинвазивные методы диагностики нефросклероза, что чрезвычайно важно для детской уронефрологии. Так, перспективным является изучение факторов воспаления, биомаркеров повреждения структур нефрона ферментной и белковой природы, факторов тканевой гипоксии, играющих важную роль в развитии нефросклероза у детей [1, 4, 5]. Определение
данных биомаркеров позволит объективно оценивать степень почечного повреждения, эффективность проводимого лечения, а также прогнозировать течение заболевания, снизжать частоту развития осложнений.

До настоящего времени недостаточно изучена степень участия различных маркеров в развитии и прогрессировании поражения почек у детей, не доказаны чувствительность и специфичность их определения для диагностики нефросклероза при данных патологических изменениях, отсутствуют данные относительно количественных показателей мочевой экскреции различных факторов у практически здоровых детей, не имеющих нарушений со стороны мочевыделительной системы. Все это побудило нас к поиску скрининговых, высокочувствительных, специфичных, малоинвазивных и простых методов ранней диагностики нефросклеротических изменений у детей с ПМР.

Целью нашего исследования стало уточнение чувствительности и эффективности различных методов диагностики нефросклероза у детей с ПМР при сопоставлении результатов стандартных клинико-лабораторных и инструментальных методов исследования с изменением уровня биомаркеров повреждения почек в моче в динамике заболевания (до и через 6 мес. после лечения).

Материалы и методы. 140 пациентам с ПМР проведен стандартный комплекс обследования, включивший клинические, лабораторные, рентгеноурологические (экскреторная урография и микционная цистоуретрография) и ультразвуковые методы исследования. С целью оценки секреторно-эвакуаторной функции почек детям по достижении 4-летнего возраста проведена динамическая нефросцинтиграфия с определением скорости клубочковой фильтрации.

Все пациенты были разделены на три группы в соответствии со степенью рефлюкса и методом его
коррекции. В 1-ю группу вошли 30 пациентов со II–III степенями ПМР, которым было проведено консервативное лечение рефлюкса, во 2-ю – 88 пациентов с III–V степенями рефлюкса, которым была выполнена эндоскопическая коррекция рефлюкса, в 3-ю – 22 пациента с III–IV степенями рефлюкса, которым осуществлена реимплантация мочеточников. Средний возраст детей составил 4,5±3,6 года.

Для оценки степени активности воспалительного процесса, а также выявления и оценки выраженности диспластических и склеротических процессов в МВП 25 пациентам 1-й группы, 39 – 2-й и 16 – 3-й группы изучены содержание биологических маркеров воспаления в моче – моноцитарного хемоаттрактантного протеина 1 (МСР-1), фиброгенеза – трансформирующего фактора роста β1 (TGF-β1), ангиогенеза – васкулоэндотелиального фактора роста (VEGF); повреждения основных структур нефрона – π-глутатион-s-трансферазы (π-GST) и α-глутатион-s-трансферазы (α-GST), коллагена IV типа. Определение в моче различных биомаркеров осуществлено методом твердофазного иммуноферментного анализа с помощью различных сертифицированных тест-систем “Вектор
БЕСТ” (Россия), “Invitrogen”, ARGUTUS MEDICAL и “Bender Medsystems” (Австрия).

В группу сравнения вошли 20 детей с пупочной или паховой грыжей, в предоперационном периоде
стратифицированных по полу и возрасту (средний возраст – 4,3±3,5 года).

Результаты. Для больных 1-й и 2-й групп по данным УЗИ имело место достоверное уменьшение ширины почки и толщины почечной паренхимы в сопровождении увеличения концентрации TGF-β1 в моче
(p<0,01), причем уровень данного маркера у детей 2-й группы был достоверно выше, чем в 1-й (p<0,05) (табл. 1). Вероятно, уже при малых степенях рефлюкса у пациентов 1-й группы замечены начальные признаки повреждения почечной паренхимы, однако нарушения секреторной функции почек, по результатам экскреторной урографии и динамической нефросцинтиграфии, при этом не происходило. У больных 2-й группы независимо от длительности существования рефлюкса происходило более значительное повреждение почечной паренхимы с развитием нефросклероза. Однако подавляющее большинство почек характеризовалось нормальной секреторной функцией почек. Концентрация TGF-β1 в моче детей 3-й группы до реимплантации мочеточников не отличалась от показателей группы сравнения. Возможно, снижение данного фактора до нормального уровня свидетельствовало о поздних этапах нефросклеротического процесса, поскольку, накапливаясь в большом количестве в интерстиции, TGF-β1 активировал ряд клеток с последующим активным выбросом других цитокинов (МСР-1), которые обеспечивали поддержание и прогрессирование процесса рубцевания в почках. Однако снижение секреторной функции почек по результатам экскреторной урографии или динамической нефросцинтиграфии диагностировано лишь в одной почке.

Таблица 1. Содержание TGF-β1 (в нг/мл) в моче пациентов с ПМР до и после лечения (Me [LQ; HQ]).

Через 6 мес. после проведенного комплексного консервативного лечения больных в возрасте до года отмечена нормализация показателей толщины паренхимы и ширины почек, тогда как у детей старше года уменьшенные размеры почек сохранялись. Однако уровень TGF-β1 в моче был повышен у всех больных по сравнению с исходным (p<0,05). У детей после эндоскопической коррекции и реимплантации мочеточников отмечено сохранение размеров почек ниже нормы по данным ультразвукового исследования (табл. 1), а также уменьшение секреторной функции лишь в 13%
наблюдений, что сопровождалось значительным повышением содержания TGF-β1 в моче (p<0,05).

Таким образом, определение в моче TGF-β1 позволило зарегистрировать ранние этапы повреждения
почечной паренхимы у детей с ПМР в отсутствие изменений по результатам стандартных методов исследования.

Уровень МСР-1 как ведущего фактора в инициации и поддержании хронического воспалительного процесса сопоставляли с результатами общего анализа мочи. Среди пациентов 1-й и 2-й групп до
лечения воспалительные изменения в МВП по данным общего анализа мочи зарегистрированы у 22%
пациентов, причем в основном минимальной степени выраженности в 1-й группе и средней степени
– во 2-й. Этому соответствовало отсутствие достоверно значимого повышения уровня МСР-1 в моче
у детей 1-й (p>0,08) и 2-й (p>0,25) групп. Вероятно, это было связано с активным процессом накопления хемокина в клетках моноцитарно-макрофагального ряда с формированием воспалительных инфильтратов и свидетельствовало о наличии латентного хронического воспалительного процесса в МВП. В 3-й группе фактически у половины детей имела место лейкоцитурия различной степени выраженности, а у третьей части – протеинурия. Установленные изменения сопровождались значительным подъемом уровня MCP-1 в моче, что указывало на активацию воспалительного процесса в МВП (табл. 2).

Через 6 мес. после лечения лейкоцитурией страдали только один ребенок 1-й группы, большинство пациентов 2-й, исходно имевших воспалительные изменения в моче, и 1 ребенок 3-й группы с неликвидированным рефлюксом, однако содержание MCP-1 в моче было увеличено у всех детей независимо от успешности устранения рефлюкса, причем наиболее значимое в 3-й группе (табл. 2). По всей видимости, данный факт был связан с продолжающимся латентным хроническим воспалением
в МВП, несмотря на ликвидацию рефлюкса.

Таблица 2. Содержание MCP-1 (в пг/мл) в моче у пациентов с ПМР до и после лечения (Me [LQ; HQ]).

Таким образом, результаты традиционных лабораторных методов исследования позволили диагностировать только активную фазу хронического воспалительного процесса в МВП. Определение в моче МСР-1 дало возможность регистрировать латентное течение воспаления и тем самым дополнить представления о прогрессирующем повреждении почечной паренхимы у детей даже в условиях восстановленной уродинамики.

Таблица 3. Содержание VEGF (в пг/мл) в моче у пациентов с ПМР до и после лечения (Me [LQ; HQ]).

Изменения содержания в моче VEGF – основного фактора ангиогенеза сравнивали с данными допплерометрии сосудов почек. Отсутствие значимых изменений почечного кровотока в динамике течения заболевания у детей 1-й группы сопровождалось увеличением содержания VEGF в моче до лечения и его уменьшением до нормальных показателей после ликвидации рефлюкса в подавляющем большинстве почек (табл. 3). Данный факт свидетельствовал о невозможности регистрировать минимальные изменения кровотока при проведении стандартной допплерометрии сосудов почек. Усиленная выработка VEGF подтверждала наличие тканевой гипоксии в условиях ремоделирования кровотока. Устранение гидродинамического удара после проведенного консервативного лечения приводило к восстановлению внутрипочечной гемодинамики и нормализации содержания данного
фактора. Снижение интенсивности почечного кровотока у половины детей 2-й группы сопровождалось увеличением содержания VEGF в моче до лечения и уменьшением его показателей после ликвидации рефлюкса в большинстве почек (табл. 3). Однако, несмотря на снижение значений данного фактора после коррекции, его уровень в моче был выше (p<0,00008), чем в группе сравнения. Следует отметить, что метод допплерометрии сосудов почек позволил проследить снижение почечного кровотока только у половины больных. По-видимому, регистрировались только выраженные изменения почечного кровотока. Однако увеличение концентрации VEGF установлено всем пациентам 2-й группы. Данный факт свидетельствовал о невозможности регистрировать незначительные изменения почечной гемодинамики и начальные этапы ремоделирования кровотока с помощью стандартной допплерометрии сосудов почек. Снижение уровня VEGF в моче после лечения независимо от успешности ликвидации рефлюкса могло быть доказательством как улучшения почечной гемодинамики, так и нарушения его рецепции эндотелием сосудов в условиях длительной тканевой гипоксии. В 3-й группе снижение паренхиматозного кровотока при допплерометрии сосудов почек диагностировано у 70% детей, причем с отсутствием подкапсульного кровотока у четверти из этих пациентов. Следует отметить, что изменения содержания VEGF в моче у больных 3-й группы имели сходный характер с изменениями данного фактора у детей 1-й и 2-й групп, однако наиболее значимое
его повышение наблюдалось у детей 3-й группы. Через 6 мес. после реимплантации мочеточников, несмотря на ликвидацию рефлюкса по результатам допплерометрии, отмечено увеличение количества почек со сниженным кровотоком по отношению к исходным данным. Параллельно сохранялись повышенными значения VEGF в моче относительно группы сравнения. Но при сопоставлении с показателями данного маркера до реимплантации мочеточников было зарегистрировано его достоверное снижение, что свидетельствовало о прогрессирующем течении нефросклеротического процесса у этих пациентов.

Рисунок. ROC-кривые, отражающие диагностическую эффективность определения VEGF коллагена IV типа п=GST для оценки раннего повреждения почечной паренхимы.

Таким образом, определение уровня VEGF в моче дало возможность установить необходимость стимуляции ангиогенеза на фоне ремоделирования кровотока у детей с ПМР, тогда как стандартный метод допплерометрии сосудов позволял диагностировать только выраженные дефекты почечной гемодинамики в условиях длительно нарушенного пассажа мочи. Данные определения маркеров повреждения дистальных канальцев (π-GST), гломерулярной базальной мембраны (коллаген IV типа) сопоставляли с результатами УЗИ и экскреторной урографии или динамической нефросцинтиграфии. У детей всех групп отмечено уменьшение толщины почечной паренхимы, ширины почек и повышение содержания вышеуказанных биомаркеров, причем максимальные их концентрации в моче имели место среди пациентов 3-й группы (табл. 4). Нарушение секреторной функции заметили лишь в трех почках во 2-й группе и одной – в 3-й. В 1-й группе снижения секреторной функции не было диагностировано ни у одного пациента.

Через 6 мес. после комплексного консервативного лечения больных произошло уменьшение уровней коллагена IV типа и π-GST в моче до значений группы сравнения и возвращение размеров почек по данным сонографии к норме у пациентов возрастной подгруппы до 1 года. По всей видимости, это
отражало незначительное и обратимое повреждение почечной паренхимы на фоне кратковременно существующей нарушенной уродинамики. У детей старше 1 года такой взаимосвязи выявлено не было. Размеры почек оставались уменьшенными, однако секреторная функция почек всех пациентов этой группы независимо от длительности существования рефлюкса была в норме. У детей после эндоскопической коррекции сохранены ультразвуковые показатели размеров почек ниже нормы, а также уменьшение секреторной функции лишь для 3 пациентов, что сопровождалось снижением содержания коллагена IV типа и π-GST по сравнению с исходными данными, при этом не достигшими показателей группы сравнения. По всей видимости, падение концентрации коллагена IV типа указывало на уменьшение количества нефронов в состоянии гиперфильтрации на фоне ликвидированного рефлюкса. Снижение количества π-GST, вероятно, было связано с уменьшением интенсивности повреждения тубулоэпителиальных клеток при нормализованном оттоке мочи. У пациентов после реимплантации мочеточников на фоне устраненного рефлюкса ультразвуковые изменения оказались аналогичными исходным, однако нарушение секреторной функции отмечено в
двух почках, ранее функционировавших нормально. Патологические сдвиги содержания биомаркеров повреждения основных структур нефрона в моче носили сходный характер с изменениями во 2-й группе. Следует отметить, что, несмотря на ликвидированный рефлюкс, уровни коллагена IV типа и π-GST после лечения были достоверно выше значений данных факторов в моче во 2-й группе. Вероятно, имело место продолжающееся развитие нефросклероза даже в условиях восстановленного пассажа мочи.

Для оценки диагностической эффективности исследования биологических маркеров повреждения основных элементов нефрона, воспаления, фиброгенеза, ангиогенеза в моче был проведен ROC-анализ с построением характеристических кривых при разных точках разделения значений показателей. Было установлено, что наибольшей чувствительностью и специфичностью для регистрации раннего повреждения почечной паренхимы у детей с ПМР обладали VEGF, а также π-GST и коллаген IV типа. Для всех указанных показателей площадь под характеристической кривой (AUC) составила от 0,9 до 1,0, что свидетельствовало о высокой чувствительности и специфичности
для мониторирования течения нефросклеротического процесса (см. рисунок).

Поскольку с точки зрения основных закономерностей развития нефросклероза имеют значение не абсолютные значения уровней биомаркеров повреждения паренхимы почек, а баланс основных фракций, определяющих направленность течения патологического процесса, нами был предложен индекс раннего повреждения почек (ИРПП). ИРПП рассчитывался как соотношение концентраций наиболее чувствительных и точных маркеров: VEGF и коллагена IV типа. Анализ изменения ИРПП у больных ПМР показал, что исходно отмечено его резкое увеличение во всех группах пациентов по сравнению с группой сравнения (табл. 5). У пациентов 2-й группы значения ИРПП были достоверно выше аналогичных показателей в 1-й группе, однако наиболее высокие показатели ИРПП наблюдались в 3-й группе. Через 6 мес. после лечения возникло снижение ИРПП во всех группах пациентов, причем в 1-й группе – до значений группы сравнения, а во 2-й и 3-й – до показателей, достоверно выше, чем
в группе сравнения (см. табл. 5).

Таблица 4. Содержание π-GST и коллагена IV типа в моче у пациентов с ПМР до и после лечения (Me (LQ; HQ)).

Таблица 5. ИРПП у пациентов с ПМР до и после лечения (Me [LQ; HQ]).

Обсуждение. Установленные изменения биомаркеров воспаления, фиброгенеза, ангиогенеза в моче в динамике течения заболевания свидетельствовали о повреждении почечной паренхимы даже при малой степени ПМР. Изменения содержания вышеуказанных параметров происходили на самых ранних этапах нефросклеротического процесса – до того как стандартные методы определения структурно-функционального состояния почек позволяли диагностировать грубые нарушения. Кроме того, на фоне ликвидированного рефлюкса в большинство почек пациентов 1-й группы наблюдалось отсутствие патологических сдвигов по результатам всех методов стандартного комплекса обследования, кроме ультразвукового, а также нормализация содержания в моче ангиогенных факторов и маркеров повреждения гломерулярного фильтра. Вероятно, исходно выявленные изменения были умеренно выраженными и имели обратимый характер. Во 2-й и 3-й группах изменения маркеров повреждения почечной паренхимы были более стойкими и свидетельствовали о тяжелых, возможно необратимых, нарушениях.

Заключение

1. Проявлением рефлюксной нефропатии являются диспропорция и отсутствие роста почки, нарушение гемодинамики, на поздних этапах – снижение секреторной функции.
2. Выраженность патологических сдвигов биологических маркеров повреждения почечной паренхимы
в моче коррелирует со степенью и длительностью существования ПМР. Характер установленных изме-
нений имеет достоверную взаимосвязь со структурно-функциональными изменениями почек,
выявленными в ходе традиционного обследования. Повышение уровней TGF-β1, МСР-1, коллагена IV
типа, π-GST и VEGF в моче позволяет диагностировать ранние этапы формирования нефросклероза
и латентную фазу хронического воспалительного процесса в МВП.
3. Наиболее высокую чувствительность и специфичность для определения степени повреждения паренхимы почек у детей в динамике течения патологии имеет исследование в моче основных маркеров повреждения нефрона – коллагена IV типа и π-GST, а также факторов ангиогенеза – VEGF. Расчет индекса раннего повреждения почек до и через 6 мес. после лечения позволяет объективно оценивать этапность развития нефросклероза.

Исследование выполнено при поддержке Гранта Президента МД-303.2010.7.