English
Стволовые и прогениторные клетки при введении в организм обладают способностью стимулировать регенерацию тканей и органов путем дифференцировки в специализированные клетки. В зависимости от способности к дифференцировке используемые в терапии стволовые клетки (СК) классифицируют на несколько видов.
- Тотипотентные клетки обладают максимальным потенциалом к дифференцировке, могут трансформироваться в клетки практически любых тканей. К таким клеткам относятся зигота и клетки морулы. Крайне онкогенны, при введении в ткани склонны к образованию тератом.
- Плюрипотентные клетки. Данные клетки могут дифференцироваться в клетки одного из трех первичных эмбриональных слоев. Примером являются эмбриональные клетки. Обладают умеренным онкогенным потенциалом.
- Мультипотентные клетки способны к самообновлению, могут дифференцироваться в клетки отдельных органов и тканей. К ним относятся гематопоэтические стволовые клетки, мезенхимальные стволовые клетки, нейральные стволовые клетки. Низкоонкогенны.
- Унипотентные клетки трансформируются только в один тип тканей – эпителиальные клетки. Практически не онкогенны.
- Индуцированные плюрипотентные клетки. Данные клетки перепрограммированы, т.е. над соматическими дифференцированными клетками проведены манипуляции (введен набор транскрипционных факторов), изменяющие экспрессионный профиль клетки. Индуцированные плюрипотентные клетки, подобно эмбриональным, могут дифференцироваться в клетки различных органов и тканей, исследования их онкогенности продолжаются.
Использование СК в медицине, в частности в урологии, основано на том факте, что в организме человека при тканевой деструкции любого генеза СК, обычно находящиеся в покое, начинают интенсивно делиться и дифференцироваться, стимулируя регенерацию окружающих органов и тканей [1]. На состояние СК в первую очередь влияет их микроокружение, в частности концентрация цитокинов, парциальное давление кислорода в ткани и другие физико-химические параметры внутренней среды [2]. В урологии используют все из вышеперечисленных видов СК, кроме тотипотентных СК. Терапию СК в урологии применяют для лечения эректильной дисфункции, недержания мочи, болезни Пейрони, а также мужского бесплодия.
Мужское бесплодие
Патогенез бесплодия. Терапия цитостатиками, другие формы противоопухолевой химиотерапии, а также воздействие радиации могут вызывать стойкое поражение прогениторных половых, а также соматических клеток, необходимых для созревания сперматозоидов, таких как клетки Сертоли и клетки Лейдига. Степень поражения определяется типом опухолевого заболевания, возрастом больного и длительностью лечения [3]. Цитотоксические препараты могут прямо нарушать сперматогенез, разрушая сперматогонии [4].
Использование клеточной терапии для лечения бесплодия. Выделение и криозаморозка сперматогенных СК перед началом терапии цитостатиками позволяют сохранять детородную функцию пациентам с онкологическими заболеваниями. Данная методика включает биопсию тканей яичка и их последующую заморозку. В дальнейшем может быть проведена стимуляция in vitro сперматогенеза или осуществлена аутологичная трансплантация тканей в семенники пациента. Данная процедура была успешно осуществлена с использованием большого числа животных моделей [5].
Эректильная дисфункция
Эректильная дисфункция (ЭД) определяется как стойкая неспособность к достижению или поддержанию эрекции, достаточной для успешного полового акта, которая может значительно ухудшать качество жизни больных [6]. По оценкам, распространенность ЭД составляет 20% среди мужчин от 40 лет и старше с более высоким показателем распространенности среди пожилых мужчин [7]. Есть несколько вариантов лечения ЭД, включая изменение образа жизни, фармакотерапию (орально – ингибиторы фосфодиэстеразы 5-го типа, инъекции алпростадила и его аналогов в пещеристое тело полового члена), хирургическое вмешательство для реваскуляризации пениса или введения имплантатов [8]. Несмотря на эффективность многих из этих методов лечения ЭД, ограничения по их использованию, например различные лекарственные взаимодействия (ингибиторы фосфодиэстеразы 5-го типа с препаратами для лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы), наличие побочных эффектов, высокая стоимость и необходимость постоянного лечения, приводят к тому, что не все пациенты перестают страдать от симптомов ЭД [8]. Вышеописанные способы лечения обеспечивают снятие симптомов заболевания, но не излечивают его, таким образом, актуально использование инновационных методов этиологической терапии, к которым относится клеточная терапия [9].
Патогенез ЭД. С возрастом в тканях полового члена сокращается кровоток, уменьшается реактивность кавернозных нервов [10]. Также падает концентрация оксида азота (NO) в крови, что связано с высоким уровнем активных форм кислорода, вызывающих дисфункцию сосудистого эндотелия [11]. Гистологические изменения, такие как замещение гладких мышц фиброзной тканью и разрушение эластических волокон, также могут быть обусловлены возрастом [12]. Метаболические нарушения, включая сахарный диабет, артериальную гипертензию и дислипидемию, также могут приводить к ЭД. Для сахарного диабета и артериальной гипертензии характерно уменьшение интракавернозного уровня NO, поражение эндотелия и гладких мышц сосудов [13]. Для гиперлипидемии характерно также поражение нервных окончаний [14]. Кроме того, причиной нарушения эректильной функции может быть повреждение кавернозного нерва, например, в ходе проведения радикальной простатэктомии по поводу рака простаты. Даже при использовании особых нервосохраняющих вариантов оперативного вмешательства около 20% пациентов страдают от симптомов ЭД в течение двух лет после операции [15]. Это может быть связано с нейропраксией, апоптозом гладких мышц или с фиброзом тканей пениса [16]. Радиационная терапия рака приводит к ЭД по тому же механизму [17].
Возможности терапии СК при ЭД. Для клеточной терапии ЭД использовались различные типы клеток. Эмбриональные СК значительно улучшали эректильную функцию при нейрогенных вариантах ЭД [18]. Однако этические аспекты ограничили проведение дальнейших исследований с данным типом клеток. В одной из работ была показана способность трансфецированных фактором роста эндотелия сосудов прогениторных клеток повышать потенцию у крыс, страдающих диабетом [19]. Несколько доклинических исследований продемонстрировали эффективность терапии ЭД стволовыми клетками, полученными из костного мозга. Использовались модели старения, диабета, повреждения кавернозного нерва [20–22]. Также в лечении ЭД применяли выделенные из скелетных мышц СК. Данные клетки, которые могут быть получены из биопсийного материала, показали эффективность на крысиных моделях старения и моделях с повреждением кавернозного нерва [23, 24]. Стволовые клетки, выделенные из нервного гребня, могут дифференцироваться в гладкомышечные клетки и в клетки сосудистого эндотелия при введении в пенис крысы [25]. Наиболее широко используемый вид СК, применяемых для лечения ЭД, – СК, выделенные из жировой ткани [9]. Механизм их действия реализуется путем секреции цитокинов, стимуляции ангиогенеза, а также дифференцировки в клетки сосудистого эндотелия, гладкомышечные клетки и нейроны [26–28]. Также были изучены СК, выделенные из мочи, и было показано, что их применение для лечения ЭД также эффективно [29].
Методы доставки СК. Действие СК может быть усилено посредством улучшения характеристик клеток за счет генетического модифицирования клеток, инкубирования их со скаффолдами, ростовыми факторами или другими биологически активными субстанциями. Терапевтический эффект при инъекционном введении СК в системный кровоток достигается за счет миграции СК в область поражения [30]. Внутривенное введение мезенхимальных СК (МСК) сопровождалось значительным улучшением эректильной функции [30]. Регенеративный эффект СК достигается за счет выделения ими в кровь ростовых факторов и их миграции в major pelvic ganglia [9]. Прямое введение СК в major pelvic ganglia не было изучено ввиду сложности инъекции [18, 31]. Также были эксперименты с введением СК в перипростатическое венозное сплетение [32–34]. В модели с повреждением кавернозного нерва внутрибрюшинное введение СК для восстановления эректильной функции оказалось менее эффективным, чем внутрикавернозное [35].
Болезнь Пейрони
Болезнь Пейрони, или фибропластическая индурация полового члена, – заболевание, характеризуемое фиброзной мультифокальной структурной дегенерацией белочной оболочки полового члена. Болезнь Пейрони сопровождается образованием фиброзных бляшек в белочной оболочке и прилегающей кавернозной ткани, обусловливает возникновение болезненных эрекций и искривление эрегированного пениса [36].
Патогенез болезни Пейрони. Точные причины болезни Пейрони неизвестны. Наиболее широко принятая теория – повторяющиеся микротравмы эрегированного пениса являются причиной воспаления, разрушения эластических волокон и накопления фибрина [37]. Некоторые исследователи связывают травму сосудов с образованием остеоидных бляшек из остеобластоподобных клеток, образованных из сосудистой оболочки [38]. Также указывается на повышение уровня экспрессии отдельных генов, в частности остеобластспецифического фактора I, что приводит к кальцификации бляшек [39]. Согласно другой теории, причиной болезни Пейрони является гипоксия тканей пещеристого тела, которая способствует накоплению коллагена и фиброзу. Данная гипотеза может объяснить морфологические изменения и развитие болезни Пейрони после простатэктомии [40]. Трансформирующий ростовой фактор бета может стимулировать продукцию коллагена фибробластами и миофибробластами, что сопровождается образованием бляшек [37]. Однако точный механизм кальцификации и оссификации тканей остается неопределенным [41].
Использование терапии СК для лечения болезни Пейрони. Основываясь на подходах регенеративной медицины, можно разрабатывать новые методы лечения болезни Пейрони, например, с использованием МСК [42]. Расположение пениса технически упрощает введение СК. Более того, технология получения мультипотентных МСК уже хорошо отработана: они доступны и при их использовании не возникает практически никаких этических проблем (в отличие от эмбриональных СК). Применение аутологичных МСК решает проблему иммуносовместимости донора и реципиента [43]. Мезенхимальные СК могли бы стать наиболее широко используемым в урологии типом СК, они легко выделяются и хорошо поддаются культивированию [43]. Точный механизм действия МСК при болезни Пейрони и подобных заболеваниях до конца не выяснен; МСК могут дифференцироваться и замещать поврежденные ткани, выделять цитокины и ростовые факторы, уменьшать уровень воспаления и изменять структуру межклеточного матрикса [44]. В одном из исследований показана способность МСК мигрировать в место повреждения тканей, хемоаттрактантами могут выступать цитокины [45]. У крыс, которым в ткани полового члена вводили трансформирующий ростовой фактор бета с целью создания модели болезни Пейрони, МСК ингибировали развитие болезни, сокращали образование волокон коллагена III типа и эластина [46]. Данные исследования могут служить основой для использования МСК в этиологической терапии болезни Пейрони, для остановки развития данного заболевания на ранних стадиях.
Недержание мочи
Недержание мочи (НМ) определяют как непроизвольное выделение мочи, не поддающееся волевому усилию [47]. Им страдают более 200 млн людей по всему миру [48]. Выделяют два типа НМ: стрессовое недержание, возникающее при напряжении, и ургентное – при ургентном (повелительном) позыве. Около половины женщин старше 20 лет хотя бы иногда страдают от недержания мочи. По статистике, примерно у 25% пациенток наблюдается стрессовое НМ, 75% – страдают от ургентного НМ и смешанных типов [49]. Использование консервативных способов лечения и фармакотерапии при стрессовом НМ клинически малоэффективно, успешные результаты связаны с установкой уретральных слингов или искусственных мочевых сфинктеров [49]. Таким образом, имеется необходимость в разработке менее инвазивных эффективных способов лечения стрессового НМ и терапия СК может стать одним из них [49].
Мочеиспускательный канал представляет собой многослойную структуру, состоящую из эпителия, соединительной ткани и гладких мышечных волокон, а также мелких кровеносных сосудов. В животных моделях стрессового НМ мышечные волокна значительно редуцированы [50], а поскольку СК могут дифференцироваться в том числе и в клетки мышечной ткани, в некоторых работах СК использовали в лечении стрессового НМ для восстановления мышечного слоя уретры [51]. Кроме того, СК секретируют ангиогенные и мускулогенные факторы, которые усиливают регенеративный эффект клеточной терапии [51]. Введение МСК позволяет восстанавливать слой соединительной ткани мочеиспускательного канала, увеличивать продукцию коллагена и эластина [51].
Доклинические исследования. Первоначальная концепция клеточной терапии для лечения НМ базировалась на использовании миобластов, выделенных из скелетных мышц, для замещения и регенерации мышц уретрального сфинктера [52]. Затем в 2002 г. было предложено использовать СК мышечной ткани вместо миобластов [53]. Вплоть до 2007 г. такие исследования проводились исключительно на животных. Затем было проведено 5 доклинических исследований с использованием СК, выделенных из костного мозга [54–58]. В одном из них [57] использовали не клеточную суспензию, а тканеинженерную конструкцию, уретральный слинг, представляющий собой подложку из шелка, на которой были адгезированы СК костного мозга. В работе [59] применяли СК пуповинной крови. Гораздо более широко для лечения НМ использовали МСК – в 7 доклинических исследованиях, в том числе в виде слоя клеток, нанесенного на микросферы из волокон шелка [51, 60–65]. В трех исследованиях использовали СК, выделенные из амниотической жидкости [66–68]. Введение всех типов СК сопровождалось значительными улучшениями в животных моделях. Большинство доклинических исследований было проведено на крысах, некоторые – на мышах [66–68], одно – на обезьянах [69]. Моделирование НМ осуществляли по различным методикам. В частности, сфинктер повреждали путем прижигания, инъекционного введения миотоксина или с помощью электрокоагуляции; пудентальный или седалищный нерв рассекали. Стимуляция родовой деятельности, расширение влагалища и овариэктомия – наиболее широко используемые для имитации родовых травм уретры методики [48, 70–72]. Недостатком данных подходов является малая длительность эффекта – от 2 до 3 нед [72–75]. Введение СК осуществлялось посредством периуретральных инъекций. В одном из исследований [51] СК вводили как периуретрально, так и внутривенно, причем положительный эффект был достигнут вне зависимости от пути введения.
Для оценки эффективности терапии СК применяли функциональные и гистологические тесты. В качестве функционального показателя использовали давление утечки мочи [48]. Гистологически определяли расположение СК, оценивали степень их дифференцировки и степень регенерации ткани. В нескольких исследованиях для оценки эффективности терапии использовали иммуногистохимическую и иммуноэлектронную микроскопию [48]. Доклинические исследования по оценке эффективности клеточной терапии при недержании мочи представлены в табл. 1.
Клинические исследования. Пять клинических исследований, проведенных одной и той же группой исследователей в 2007-м и 2008 г., продемонстрировали эффективность введения СК, выделенных из скелетных мышц, для лечения больных со стрессовым НМ. Улучшение было продемонстрировано у 80–90% пациентов [61, 76–80]. Было показано, что 5 из 8 женщин, страдавших стрессовым НМ, при использовании СК, выделенных из мышечной ткани, полностью излечивались [81]. В другом исследовании от 70 до 80% пациенток отметили значительное улучшение при использовании СК пуповинной крови [81]. Небольшое количество клинических исследований с применением МСК было вскоре по неизвестным причинам прекращено [82].
Использование СК скелетных мышц у 12 пациенток с НМ привело к улучшению состояния у 10 из них, однако у 2 были отмечены признаки ухудшения состояния [83]. Метод введения СК в большинстве клинических испытаний – трансуретральный, в работе [81] СК вводили как трансуретрально, так и периуретрально, в обоих случаях достигнут положительный эффект.
T. Yamamoto и соавт. [84] трем пациентам мужского пола, страдавшим НМ, в течение 6 мес вводили аутологичные МСК, полученные из жировой ткани. У всех пациентов наблюдалось улучшение. Также улучшение констатировали 8 из 11 мужчин, которым МСК вводили в течение года [85]. Исследование польских врачей, в котором участвовали 16 пациенток, продлилось 2 года. У 75% пациенток наблюдалось улучшение, 50% больных заявили о полном излечении от НМ [86]. Согласно данным [87], у 3 из 5 пациенток было отмечено прогрессирование в лечении НМ с использованием МСК в течение года.
Эффективность клеточной терапии в клинических исследованиях оценивали с использованием функциональных показателей: пад-теста (изменение массы прокладки до и после физических упражнений), путем изучения дневников мочеиспусканий, уродинамических показателей (максимального давления закрытия уретры, объема остаточной мочи и др.) [48]. Клинические исследования по оценке эффективности клеточной терапии при недержании мочи представлены в табл. 2.
Заключение. Мезенхимальные СК представляют собой наиболее доступный и простой в получении вид СК [100], поэтому дальнейшее использование СК в урологии, по-видимому, связано с применением именно этого типа клеток. Разработка технологии получения индуцированных плюрипотентных СК позволит испытать этот принципиально новый тип СК в терапии урологических нарушений. Также актуальной задачей остается создание адекватных животных моделей, позволяющих объективно оценивать эффекты клеточной терапии.
Благодарность
Исследование выполнено при поддержке гранта РНФ № 15-15-00132 (Новые фотополимеризующиеся биосовместимые композиции и скаффолды для регенеративной и реконструктивной урологии, создаваемые методом лазерного 3D принтинга).
