Association of polymorphism of GSTT1 and GSTM1 genes with infertility in men


N.A. Kurashova, E.V. Belyaeva, O.A. Ershova, B.G. Dashiev, T.A. Bairova, L.I. Kolesnikova

Research Center for Family Health and Human Reproduction, Irkutsk, Russia; Republican Perinatal Center of Minzdrav of BR, Ulan-Ude, Russia
Aim. To identify the association between homozygous deletion genotypes of glutathione transferase genes GSTT1 (glutathione transferase theta 1), GSTM1 (glutathione S-transferase mu1) and infertility in Russian menю.
Materials and methods. The article presents a comparative analysis of the incidence of homozygous deletion genotypes of glutathione transferase genes GSTM1 and GSTT1 in Russian men with and without infertility. The study group comprised 160 infertile Russian men of reproductive age (mean age 30.2±3.6 years.) The infertility diagnosis was verified according to the WHO guidelines. The control group comprised 104 healthy Russian volunteers (mean age 31.3±5.4 years.) Molecular genetic detection of GSTM1 and GSTT1 deletion polymorphisms was performed using PCR. The genomic DNA for the study was extracted from whole blood samples.
Results. The study and control group differed significantly in incidence of GSTM1 (p=0.043) and GSTT1 (p=0.008) deletion polymorphisms. The probability of detecting «zero» genotypes of the GSTT1 and GSTM1 genes in infertile men was 2.5 (p<0.05) and 1.7 times higher (p<0.05), respectively, than in fertile men.
Conclusions. Therefore, the study findings allow us to conclude that the deletion genotypes of GSTM1 and GSTT1 are associated with infertility in Russian men. Molecular genetic analysis of deletion polymorphism of glutathione transferase genes can be recommended for a comprehensive examination of infertile men.

Введение. Сохранение репродуктивного здоровья населения – важная задача демографической политики государства. По данным ряда авторов, от 14 до 30% супружеских пар репродуктивного возраста не могут иметь детей, при этом более чем в половине случаев причиной служит мужское бесплодие [1,2]. Известно, что состояние репродуктивного здоровья зависит как от внешних – экзогенных факторов, так и от наследственности человека, т.е. эндогенных факторов [3,4]. При неблагоприятном воздействии факторов окружающей среды особое значение приобретает способность организма нейтрализовать негативное влияние чужеродных для организма веществ – ксенобиотиков. Биотрансформация ксенобиотиков представляет собой каскадный процесс, включающий этапы: активации – фаза I, детоксикации – фаза II, и выведения – фаза III [5]. Фаза детоксикации ксенобиотиков происходит при непосредственном участии ферментов глутатионтрансфераз, которые обеспечивают превращение промежуточных метаболитов в водорастворимые нетоксичные соединения [6].

Наряду с детоксикацией ксенобиотиков глутатионтрансферазы участвуют в антиоксидантной защите клетки. Эту функцию они выполняют благодаря способности восстанавливать органические гидроперекиси до спиртов, используя глутатион в качестве косубстрата, в результате чего происходит обезвреживание продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) и пероксидов ДНК [7]. Таким образом, участвуя в процессах детоксикации ксенобиотиков и в работе антиоксидантной системы, глутатионтрансферазы катализируют связывание глутатиона с функциональными группами эндогенных и зкзогенных соединений (канцерогенов, липидов, продуктов ПОЛ), защищая клетку от их токсического действия [7–9].

Так как ферменты детоксикации ксенобиотиков вовлечены во взаимодействие организма человека с внешней средой, кодирующие их гены, являются биологическими маркерами способности отдельного индивидуума противостоять отрицательному влиянию факторов внешней среды. В ряде случаев полиморфизм генов глутатионтрансфераз имеет делеционный характер и затрагивает структурную часть генов, что приводит к полному отсутствию соответствующих ферментов. Отсутствие в организме человека ферментов глутатионтрансфераз снижает возможности организма нейтрализовать действие ксенобиотиков и выполнять антиоксидантную защиту клеток, поэтому делеционный полиморфизм генов глутатионтрансфераз может вносить вклад в формирование репродуктивных нарушений [10, 11]. Известно, что репродуктивная система мужчин – одна из наиболее чувствительных систем организма, реагирующая на неблагоприятные факторы внешней среды. Поскольку ферменты системы детоксикации ксенобиотиков участвуют в метаболических реакциях, направленных на снижение активности чужеродных для организма веществ, глутатионтрансферазы играют защитную роль в процессе сперматогенеза [12]. Целью настоящего исследования было выявление ассоциации гомозиготных делеционных генотипов глутатионтансфераз GSTT1 (глутатионтрансфераза класса тета-1), GSTM1 (глутатионтрансфераза класса мю-1) с бесплодием у русских мужчин.

Материалы и методы. Основную группу исследования составили 160 русских мужчин репродуктивного возраста (средний возраст – 30,2±3,6 года), обратившихся в ГАУЗ «Республиканский перинатальный центр МЗ РБ» Улан-Удэ с проблемой бесплодия в браке. Для диагностики мужского бесплодия проводилось исследование эякулята двукратно с минимальным интервалом 2 недели, согласно документу «Руководство ВОЗ по лабораторному исследованию эякулята и сперм-цервикального взаимодействия». Диагноз «бесплодие» установлен согласно рекомендациям ВОЗ (2010) на основании анамнеза, клинического осмотра, результатов гормонального исследования, микроскопии и ПЦР соскоба из уретры, спермограммы, анализа секрета простаты, УЗИ половых органов. Контрольную группу исследования составили 104 практически здоровых русских добровольца с реализованной репродуктивной функцией и нормозооспермией (средний возраст – 31,3±5,4 года). Исследования проведены с информированного согласия обследуемых мужчин и соответствуют этическим принципам Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации (Бразилия, 2013).

Молекулярно-генетическое исследование делеционного полиморфизма в генах системы детексикации ксенобиотиков GSTT1, GSTM1 проведено с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). Материалом для проведения исследования служили пробы ДНК, выделенные из образцов цельной венозной крови, забор которой проводили в пробирки с антикоагулянтом ЭДТА-К3. Экстракцию ДНК осуществляли с использованием наборов реагентов «АмплиПрайм ДНК-сорб-В» (ООО «НекстБио», Россия), согласно рекомендациям производителя. Амплификацию специфичных участков ДНК проводили в автоматическом термоциклере «Терцик» с использованием набора реагентов «АмплиСенс GSTT1/GSTM1-EPh», производитель – ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора (Россия). Детекция продуктов амплификации осуществлена в 2%-ном агарозном геле, окрашенном бромистым этидием, результаты электрофореза регистрировали и документировали с помощью системы компьютерного гельдокументирования «GelDoc». Используемые наборы реагентов позволяли обнаруживать гомозиготные варианты генотипов по делециям в генах GSTT1, GSTM1. Гетерозиготные варианты генотипов учитывались вместе с гомозиготными без делеции. Генотипы с гомозиготной делецией в гене GSTT1, GSTM1 принято называть «делеционными» или «нулевыми».

Статистическую обработку данных проводили с использованием программы Biostat и STATISTICA, версия 6.1 (StatSoft Inc., США [правообладатель лицензии – ФГБУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» СО РАМН]). При сравнении групп исследования для анализа различий между качественными переменными использован критерий χ², для оценки разницы долей – z-критерий. Нулевую гипотезу об отсутствии статистически значимых отличий между группами отклоняли при уровне значимости 5% [13].

Для оценки вероятности обнаружения «нулевого» генотипа по генам GSTT1, GSTM1 в группе пациентов с бесплодием рассчитывали величину отношения шансов (odds ratio, OR) с указанием 95% доверительного интервала (CI – 95%). Полученные значения OR оценивали следующим образом: OR>1 – наличие фактора риска в группе с наличием исхода, OR<1 – фактор риска имеет обратную связь с вероятностью исхода, OR=1 – отсутствие фактора риска. Для решения вопроса о статистической значимости полученного значения OR оценивали величину доверительного интервала CI: если CI располагается в области справа или слева от единицы (оба значения CI>1 или CI<1), выявленная связь между наличием фактора риска и исходом статистически значима, p<0,05; если CI включает единицу (верхняя граница >1, а нижняя граница <1), различия между группами не имеют статистической значимости [14].

Результаты. Проведено молекулярно-генетическое исследование делеционного полиморфизма в двух генах глутатионтрансфераз (GSTT1, GSTM1) в группах русских мужчин: с бесплодием и реализованной репродуктивной функцией. Обнаружено, что сравниваемые группы мужчин статистически значимо различаются по частоте делеционных вариантов генотипов как по гену GSTT1 (χ²=6,987; d.f.=1; р=0,008), так и по гену GSTM1 (χ²=4,092; d.f.=1; р=0,043). Делеционный вариант генотипа по гену GSTT1 обнаружен у 28% мужчин группы с бесплодием и у 13% – группы контроля (z=2,719; p=0,007), по гену GSTM1 у 50% и 37% соответственно (z=1,948; p=0,05). Делеционный генотип одновременно в двух генах глутатионтрансфераз обнаружен у 19% мужчин с бесплодием и только у 5% мужчин группы контроля, выявленные отличия являются статистически значимыми (z=3,078; p=0,002).

Таким образом, результаты нашего исследования указывают на то, что нулевые генотипы генов глутитионтрансфераз могут служить фактором риска формирования мужского бесплодия, так как статистически значимо чаще наблюдаются в группе инфертильных мужчин. Выявленное присутствие двойной делеции в генах GSTT1, GSTM1 у 5% мужчин контрольной группы не оказало негативного влияния на их репродуктивную функцию, что может быть отчасти связано с индивидуальными особенностями, а также компенсироваться нормальной женской фертильностью.

Для количественной оценки связи делеционных вариантов генотипов (фактор риска) с бесплодием у мужчин (исход заболевания) рассчитывали OR. Оказалось, что в группе мужчин с бесплодием по сравнению с группой фертильных мужчин вероятность обнаружения «нулевого» генотипа GSTT1-гена в 2,5 раза выше(OR=2,5; CI: 1,31–4,87; p<0,05), а вероятность обнаружения «нулевого» генотипа GSTM1-гена в 1,7 раза выше (OR=1,7; CI: 1,05–2,88; p<0,05). Значение показателя OR превышает 1 как в первом, так и во втором случае, следовательно, фактор риска – нулевой генотип GSTT1, GSTM1, имеет прямую связь с вероятностью развития бесплодия у мужчин.

Обсуждение. Результаты нашего исследования об ассоциации делеционных вариантов генотипов GSTM1, GSTT1 с бесплодием у мужчин подтверждают данные других авторов. Так, исследование, проведенное в Китае, показало, что «нулевые» генотипы GSTM1, GSTT1 статистически значимо чаще регистрируются у мужчин с нарушениями сперматогенеза по сравнению с фертильными мужчинами (р=0,02 и р=0,001 соответственно) [12]. Частота «нулевого» генотипа GSTM1-гена в группе мужчин с идиопатическим бесплодием в 2 раза больше по сравнению с группой фертильных мужчин (45,2 и 20,1% соответственно, p=0,017) [15]. Кроме этого в том же исследовании выявлено, что мужчины с «нулевым» генотипом GSTM1 как с бесплодием, так и фертильные имели более низкие показатели концентрации и подвижности сперматозоидов по сравнению с носителями «позитивного» генотипа GSTM1. Также показано, что носительство «нулевого» генотипа GSTM1 совместно с неблагоприятными генотипами гена CYP1A1 (Val/Val, Ile/Val) повышает риск мужского бесплодия в 6,9 раза [16].

Вероятной причиной ассоциации «нулевых» генотипов глутатионтрансфераз с идиопатическим бесплодием у мужчин служит неспособность мужских половых клеток противостоять повреждающему действию экотоксикантов и продуктам перекисного окисления липидов. В результате этого нормальный сперматогенез нарушается, что может приводить к формированию различных патологических состояний, таких как олигозооспермия (снижение концентрации сперматозоидов), астенозооспермия (снижение подвижности сперматозоидов), азооспермия (отсутствие в эякуляте сперматозоидов). Происходит это вследствие того, что у носителей «нулевых» генотипов по генам глутатионтрансфераз отсутствуют соответствующие ферменты, которые выполняют защитную функцию клетки.

Так, результаты мета-анализа (6934 обследованных) выявили связь «нулевых» генотипов глутатионтрансфераз с нарушениями сперматогенеза у мужчин. В исследовании показано, что «нулевой» генотип GSTM1 ассоциирован с идиопатической олигозооспермией, «нулевой» генотип GSTТ1 – с азооспермией [17]. Показано, что риск олигоспермии (снижение общего количества спермы) у мужчин с «нулевым» генотипом GSTM1 в 1,6 раза выше, с «нулевым» генотипом GSTT1 в 1,5 раза выше, также у носителей «нулевого» GSTT1 генотипа риск азооспермии в 2,3 раза выше по сравнению с контролем [12]. На наличие ассоциациации «нулевого» генотипа GSTM1 с более низкой концентрацией спермы у мужчин с идиопатическим бесплодием также указывают авторы другого исследования, где было показано, что у пациентов с бесплодием и нулевым генотипом GSTM1 наблюдаются более высокие уровни окислительного стресса [18]. Отсутствие у носителей «нулевого» генотипа устойчивости к окислительному стрессу является вероятной причиной нарушения сперматогенеза у таких пациентов. Это подтверждает исследование случай–контроль, проведенное в Китае, в котором показано, что «нулевой» генотип GSTT1-гена предрасполагает к большему окислительному повреждению сперматоцитов у бесплодных пациентов с варикоцеле [19]. Также на изменения в спермограмме у мужчин с идиопатическим бесплодием и «нулевыми» генотипами глутатионтрансфераз указывают результаты исследования, в котором снижение подвижности сперматозоидов наблюдалось в группе мужчин с делеционными генотипами GSTT1, GSTM1 у 73,7 и 78,9% соответственно [4].

В другом исследовании при оценке андрогенного статуса мужчин после оперативного лечения варикоцеле обнаружено, что у носителей «нулевых» генотипов GSTM1 тератозооспермия достигала 97% [20].

Таким образом, результаты проведенного нами исследования свидетельствуют о наличии ассоциации между делеционным вариантом генотипа генов глутатионтрансфераз и бесплодием у русских мужчин. Анализ данных литературы подтверждает, что у носителей «нулевых» генотипов GSTT1, GSTM1 наблюдаются изменения в показателях спермограммы, которые проявляются такими патологическими состояниями, как олигозооспермия, астенозооспермия, азооспермия и др. Гипотеза о возможной связи между «нулевыми» генотипами генов глутатионтрансфераз и риском мужского бесплодия косвенно подтверждается данными, согласно котороым в популяциях человека, вероятно, существует механизм отбора по генам GSTM1, GSTT1. Изучение частоты генотипов GSTM1, GSTT1 в популяционной выборке из Италии, разделенной на четыре возрастные группы: 1–30 лет, 31–50, 51–79 и 80–100 лет, выявило, что в старших возрастных группах наблюдается статистически значимое снижение частоты носительства «нулевых» генотипов GSTM1, GSTT1, что свидетельствует о связи делеционных генотипов с продолжительностью жизни [21]. Эти результаты подтверждают данные другого исследования, где при сравнении частоты генотипов GSTT1 в двух группах здоровых лиц из Ирана, отличающихся по возрасту (средний возраст – 47±12,4 и 16,3±2,4 года), рассмотренные как первое и второе поколения, было обнаружено, что частота «нулевого» генотипа составила 52,1 и 36,4% соответственно, полученные отличия статистически значимы (p=0,011) [22]. Исходя из полученных данных, авторами исследования высказано предположение, что численность носителей «нулевого» генотипа во втором поколении снижается, в то время как активный вариант генотипа GSTT1, вероятно, способствует выживанию и воспроизводству, а сам полиморфизм по этому гену находится под действием естественного отбора.

Выводы. Полученные нами результаты подтвердили предположение о том, что бесплодие у мужчин ассоциировано с полиморфизмом генов GSTT1, GSTM1. У русских мужчин с бесплодием по сравнению с фертильными делеционные варианты генотипа по генам GSTM1, GSTT1 встречаются статистически значимо чаще, как отдельно по каждому гену, так и при наличии двойной делеции по двум изученным генам. В группе мужчин с бесплодием по сравнению с группой фертильных мужчин вероятность обнаружения «нулевого» генотипа GSTT1, GSTM1 в 2,5 и 1,7 раза выше соответственно. Таким образом, полиморфизм генов GSTT1, GSTM1 может вносить вклад в формирование репродуктивных нарушений у мужчин, поэтому молекулярно-генетическое исследование делеционного полиморфизма генов глутатионтрансфераз GSTT1, GSTM1 может быть рекомендовано для комплексного обследования мужчин с бесплодием.


About the Autors


Corresponding author: E. V. Belyaeva – Ph.D. (bio.sci), Researcher at the Laboratory of Personalized Medicine, Research Center for Family Health and Human Reproduction, Irkutsk, Russia; e-mail: belyeva_irk@mail.ru


Similar Articles


Бионика Медиа