Введение. Сохранение репродуктивного здоровья населения – важная задача демографической политики государства. По данным ряда авторов, от 14 до 30% супружеских пар репродуктивного возраста не могут иметь детей, при этом более чем в половине случаев причиной служит мужское бесплодие [1,2]. Известно, что состояние репродуктивного здоровья зависит как от внешних – экзогенных факторов, так и от наследственности человека, т.е. эндогенных факторов [3,4]. При неблагоприятном воздействии факторов окружающей среды особое значение приобретает способность организма нейтрализовать негативное влияние чужеродных для организма веществ – ксенобиотиков. Биотрансформация ксенобиотиков представляет собой каскадный процесс, включающий этапы: активации – фаза I, детоксикации – фаза II, и выведения – фаза III [5]. Фаза детоксикации ксенобиотиков происходит при непосредственном участии ферментов глутатионтрансфераз, которые обеспечивают превращение промежуточных метаболитов в водорастворимые нетоксичные соединения [6].

Наряду с детоксикацией ксенобиотиков глутатионтрансферазы участвуют в антиоксидантной защите клетки. Эту функцию они выполняют благодаря способности восстанавливать органические гидроперекиси до спиртов, используя глутатион в качестве косубстрата, в результате чего происходит обезвреживание продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) и пероксидов ДНК [7]. Таким образом, участвуя в процессах детоксикации ксенобиотиков и в работе антиоксидантной системы, глутатионтрансферазы катализируют связывание глутатиона с функциональными группами эндогенных и зкзогенных соединений (канцерогенов, липидов, продуктов ПОЛ), защищая клетку от их токсического действия [7–9].

Так как ферменты детоксикации ксенобиотиков вовлечены во взаимодействие организма человека с внешней средой, кодирующие их гены, являются биологическими маркерами способности отдельного индивидуума противостоять отрицательному влиянию факторов внешней среды. В ряде случаев полиморфизм генов глутатионтрансфераз имеет делеционный характер и затрагивает структурную часть генов, что приводит к полному отсутствию соответствующих ферментов. Отсутствие в организме человека ферментов глутатионтрансфераз снижает возможности организма нейтрализовать действие ксенобиотиков и выполнять антиоксидантную защиту клеток, поэтому делеционный полиморфизм генов глутатионтрансфераз может вносить вклад в формирование репродуктивных нарушений [10, 11]. Известно, что репродуктивная система мужчин – одна из наиболее чувствительных систем организма, реагирующая на неблагоприятные факторы внешней среды. Поскольку ферменты системы детоксикации ксенобиотиков участвуют в метаболических реакциях, направленных на снижение активности чужеродных для организма веществ, глутатионтрансферазы играют защитную роль в процессе сперматогенеза [12]. Целью настоящего исследования было выявление ассоциации гомозиготных делеционных генотипов глутатионтансфераз GSTT1 (глутатионтрансфераза класса тета-1), GSTM1 (глутатионтрансфераза класса мю-1) с бесплодием у русских мужчин.

Материалы и методы. Основную группу исследования составили 160 русских мужчин репродуктивного возраста (средний возраст – 30,2±3,6 года), обратившихся в ГАУЗ «Республиканский перинатальный центр МЗ РБ» Улан-Удэ с проблемой бесплодия в браке. Для диагностики мужского бесплодия проводилось исследование эякулята двукратно с минимальным интервалом 2 недели, согласно документу «Руководство ВОЗ по лабораторному исследованию эякулята и сперм-цервикального взаимодействия». Диагноз «бесплодие» установлен согласно рекомендациям ВОЗ (2010) на основании анамнеза, клинического осмотра, результатов гормонального исследования, микроскопии и ПЦР соскоба из уретры, спермограммы, анализа секрета простаты, УЗИ половых органов. Контрольную группу исследования составили 104 практически здоровых русских добровольца с реализованной репродуктивной функцией и нормозооспермией (средний возраст – 31,3±5,4 года). Исследования проведены с информированного согласия обследуемых мужчин и соответствуют этическим принципам Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации (Бразилия, 2013).

Молекулярно-генетическое исследование делеционного полиморфизма в генах системы детексикации ксенобиотиков GSTT1, GSTM1 проведено с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). Материалом для проведения исследования служили пробы ДНК, выделенные из образцов цельной венозной крови, забор которой проводили в пробирки с антикоагулянтом ЭДТА-К3. Экстракцию ДНК осуществляли с использованием наборов реагентов «АмплиПрайм ДНК-сорб-В» (ООО «НекстБио», Россия), согласно рекомендациям производителя. Амплификацию специфичных участков ДНК проводили в автоматическом термоциклере «Терцик» с использованием набора реагентов «АмплиСенс GSTT1/GSTM1-EPh», производитель – ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора (Россия). Детекция продуктов амплификации осуществлена в 2%-ном агарозном геле, окрашенном бромистым этидием, результаты электрофореза регистрировали и документировали с помощью системы компьютерного гельдокументирования «GelDoc». Используемые наборы реагентов позволяли обнаруживать гомозиготные варианты генотипов по делециям в генах GSTT1, GSTM1. Гетерозиготные варианты генотипов учитывались вместе с гомозиготными без делеции. Генотипы с гомозиготной делецией в гене GSTT1, GSTM1 принято называть «делеционными» или «нулевыми».

Статистическую обработку данных проводили с использованием программы Biostat и STATISTICA, версия 6.1 (StatSoft Inc., США [правообладатель лицензии – ФГБУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» СО РАМН]). При сравнении групп исследования для анализа различий между качественными переменными использован критерий χ², для оценки разницы долей – z-критерий. Нулевую гипотезу об отсутствии статистически значимых отличий между группами отклоняли при уровне значимости 5% [13].

Для оценки вероятности обнаружения «нулевого» генотипа по генам GSTT1, GSTM1 в группе пациентов с бесплодием рассчитывали величину отношения шансов (odds ratio, OR) с указанием 95% доверительного интервала (CI – 95%). Полученные значения OR оценивали следующим образом: OR>1 – наличие фактора риска в группе с наличием исхода, OR<1 – фактор риска имеет обратную связь с вероятностью исхода, OR=1 – отсутствие фактора риска. Для решения вопроса о статистической значимости полученного значения OR оценивали величину доверительного интервала CI: если CI располагается в области справа или слева от единицы (оба значения CI>1 или CI<1), выявленная связь между наличием фактора риска и исходом статистически значима, p<0,05; если CI включает единицу (верхняя граница >1, а нижняя граница <1), различия между группами не имеют статистической значимости [14].

Результаты. Проведено молекулярно-генетическое исследование делеционного полиморфизма в двух генах глутатионтрансфераз (GSTT1, GSTM1) в группах русских мужчин: с бесплодием и реализованной репродуктивной функцией. Обнаружено, что сравниваемые группы мужчин статистически значимо различаются по частоте делеционных вариантов генотипов как по гену GSTT1 (χ²=6,987; d.f.=1; р=0,008), так и по гену GSTM1 (χ²=4,092; d.f.=1; р=0,043). Делеционный вариант генотипа по гену GSTT1 обнаружен у 28% мужчин группы с бесплодием и у 13% – группы контроля (z=2,719; p=0,007), по гену GSTM1 у 50% и 37% соответственно (z=1,948; p=0,05). Делеционный генотип одновременно в двух генах глутатионтрансфераз обнаружен у 19% мужчин с бесплодием и только у 5% мужчин группы контроля, выявленные отличия являются статистически значимыми (z=3,078; p=0,002).

Таким образом, результаты нашего исследования указывают на то, что нулевые генотипы генов глутитионтрансфераз могут служить фактором риска формирования мужского бесплодия, так как статистически значимо чаще наблюдаются в группе инфертильных мужчин. Выявленное присутствие двойной делеции в генах GSTT1, GSTM1 у 5% мужчин контрольной группы не оказало негативного влияния на их репродуктивную функцию, что может быть отчасти связано с индивидуальными особенностями, а также компенсироваться нормальной женской фертильностью.

Для количественной оценки связи делеционных вариантов генотипов (фактор риска) с бесплодием у мужчин (исход заболевания) рассчитывали OR. Оказалось, что в группе мужчин с бесплодием по сравнению с группой фертильных мужчин вероятность обнаружения «нулевого» генотипа GSTT1-гена в 2,5 раза выше(OR=2,5; CI: 1,31–4,87; p<0,05), а вероятность обнаружения «нулевого» генотипа GSTM1-гена в 1,7 раза выше (OR=1,7; CI: 1,05–2,88; p<0,05). Значение показателя OR превышает 1 как в первом, так и во втором случае, следовательно, фактор риска – нулевой генотип GSTT1, GSTM1, имеет прямую связь с вероятностью развития бесплодия у мужчин.

Обсуждение. Результаты нашего исследования об ассоциации делеционных вариантов генотипов GSTM1, GSTT1 с бесплодием у мужчин подтверждают данные других авторов. Так, исследование, проведенное в Китае, показало, что «нулевые» генотипы GSTM1, GSTT1 статистически значимо чаще регистрируются у мужчин с нарушениями сперматогенеза по сравнению с фертильными мужчинами (р=0,02 и р=0,001 соответственно) [12]. Частота «нулевого» генотипа GSTM1-гена в группе мужчин с идиопатическим бесплодием в 2 раза больше по сравнению с группой фертильных мужчин (45,2 и 20,1% соответственно, p=0,017) [15]. Кроме этого в том же исследовании выявлено, что мужчины с «нулевым» генотипом GSTM1 как с бесплодием, так и фертильные имели более низкие показатели концентрации и подвижности сперматозоидов по сравнению с носителями «позитивного» генотипа GSTM1. Также показано, что носительство «нулевого» генотипа GSTM1 совместно с неблагоприятными генотипами гена CYP1A1 (Val/Val, Ile/Val) повышает риск мужского бесплодия в 6,9 раза [16].

Вероятной причиной ассоциации «нулевых» генотипов глутатионтрансфераз с идиопатическим бесплодием у мужчин служит неспособность мужских половых клеток противостоять повреждающему действию экотоксикантов и продуктам перекисного окисления липидов. В результате этого нормальный сперматогенез нарушается, что может приводить к формированию различных патологических состояний, таких как олигозооспермия (снижение концентрации сперматозоидов), астенозооспермия (снижение подвижности сперматозоидов), азооспермия (отсутствие в эякуляте сперматозоидов). Происходит это вследствие того, что у носителей «нулевых» генотипов по генам глутатионтрансфераз отсутствуют соответствующие ферменты, которые выполняют защитную функцию клетки.

Так, результаты мета-анализа (6934 обследованных) выявили связь «нулевых» генотипов глутатионтрансфераз с нарушениями сперматогенеза у мужчин. В исследовании показано, что «нулевой» генотип GSTM1 ассоциирован с идиопатической олигозооспермией, «нулевой» генотип GSTТ1 – с азооспермией [17]. Показано, что риск олигоспермии (снижение общего количества спермы) у мужчин с «нулевым» генотипом GSTM1 в 1,6 раза выше, с «нулевым» генотипом GSTT1 в 1,5 раза выше, также у носителей «нулевого» GSTT1 генотипа риск азооспермии в 2,3 раза выше по сравнению с контролем [12]. На наличие ассоциациации «нулевого» генотипа GSTM1 с более низкой концентрацией спермы у мужчин с идиопатическим бесплодием также указывают авторы другого исследования, где было показано, что у пациентов с бесплодием и нулевым генотипом GSTM1 наблюдаются более высокие уровни окислительного стресса [18]. Отсутствие у носителей «нулевого» генотипа устойчивости к окислительному стрессу является вероятной причиной нарушения сперматогенеза у таких пациентов. Это подтверждает исследование случай–контроль, проведенное в Китае, в котором показано, что «нулевой» генотип GSTT1-гена предрасполагает к большему окислительному повреждению сперматоцитов у бесплодных пациентов с варикоцеле [19]. Также на изменения в спермограмме у мужчин с идиопатическим бесплодием и «нулевыми» генотипами глутатионтрансфераз указывают результаты исследования, в котором снижение подвижности сперматозоидов наблюдалось в группе мужчин с делеционными генотипами GSTT1, GSTM1 у 73,7 и 78,9% соответственно [4].

В другом исследовании при оценке андрогенного статуса мужчин после оперативного лечения варикоцеле обнаружено, что у носителей «нулевых» генотипов GSTM1 тератозооспермия достигала 97% [20].

Таким образом, результаты проведенного нами исследования свидетельствуют о наличии ассоциации между делеционным вариантом генотипа генов глутатионтрансфераз и бесплодием у русских мужчин. Анализ данных литературы подтверждает, что у носителей «нулевых» генотипов GSTT1, GSTM1 наблюдаются изменения в показателях спермограммы, которые проявляются такими патологическими состояниями, как олигозооспермия, астенозооспермия, азооспермия и др. Гипотеза о возможной связи между «нулевыми» генотипами генов глутатионтрансфераз и риском мужского бесплодия косвенно подтверждается данными, согласно котороым в популяциях человека, вероятно, существует механизм отбора по генам GSTM1, GSTT1. Изучение частоты генотипов GSTM1, GSTT1 в популяционной выборке из Италии, разделенной на четыре возрастные группы: 1–30 лет, 31–50, 51–79 и 80–100 лет, выявило, что в старших возрастных группах наблюдается статистически значимое снижение частоты носительства «нулевых» генотипов GSTM1, GSTT1, что свидетельствует о связи делеционных генотипов с продолжительностью жизни [21]. Эти результаты подтверждают данные другого исследования, где при сравнении частоты генотипов GSTT1 в двух группах здоровых лиц из Ирана, отличающихся по возрасту (средний возраст – 47±12,4 и 16,3±2,4 года), рассмотренные как первое и второе поколения, было обнаружено, что частота «нулевого» генотипа составила 52,1 и 36,4% соответственно, полученные отличия статистически значимы (p=0,011) [22]. Исходя из полученных данных, авторами исследования высказано предположение, что численность носителей «нулевого» генотипа во втором поколении снижается, в то время как активный вариант генотипа GSTT1, вероятно, способствует выживанию и воспроизводству, а сам полиморфизм по этому гену находится под действием естественного отбора.

Выводы. Полученные нами результаты подтвердили предположение о том, что бесплодие у мужчин ассоциировано с полиморфизмом генов GSTT1, GSTM1. У русских мужчин с бесплодием по сравнению с фертильными делеционные варианты генотипа по генам GSTM1, GSTT1 встречаются статистически значимо чаще, как отдельно по каждому гену, так и при наличии двойной делеции по двум изученным генам. В группе мужчин с бесплодием по сравнению с группой фертильных мужчин вероятность обнаружения «нулевого» генотипа GSTT1, GSTM1 в 2,5 и 1,7 раза выше соответственно. Таким образом, полиморфизм генов GSTT1, GSTM1 может вносить вклад в формирование репродуктивных нарушений у мужчин, поэтому молекулярно-генетическое исследование делеционного полиморфизма генов глутатионтрансфераз GSTT1, GSTM1 может быть рекомендовано для комплексного обследования мужчин с бесплодием.