Введение. Рак предстательной железы (РПЖ) занимает ведущее место в структуре заболеваемости злокачественными новообразованиями в большинстве экономически развитых стран и является не только медицинской, но и социальной проблемой [1–3]. Ранняя первичная диагностика и точное прогнозирование развития любых злокачественных опухолей существенно повышают эффективность лечения онкологических заболеваний. Однако в настоящее время для большинства наиболее распространенных видов опухолей, в том числе РПЖ, не идентифицированы информативные прогностические маркеры. Разработка новых подходов к мониторингу неопластических процессов в простате на основе выявления информативных предикторов и маркеров РПЖ, особенно его агрессивных форм, – ключевая задача современной онкоурологии.

В настоящее время в клинической практике доступен ограниченный ряд методов, позволяющих осуществлять персонифицированный прогноз для пациентов с РПЖ. Уровень простатспецифического антигена (ПСА) и динамика его содержания на сегодня остаются основными предикторами прогнозирования благоприятных или неблагоприятных событий после разных стратегий лечения РПЖ [4, 5].

Ренин-ангиотензиновая система (РАС) в последние годы привлекает внимание исследователей не только как система, выполняющая «классические» функции регуляции артериального давления, водно-солевого обмена и т.д., но и в связи с ее ролью в развитии неопластической трансформации и опухолевого прогрессирования [6]. Показано, что основные компоненты РАС, такие как ангиотензин II и рецепторы, опосредующие его действие, влияют на уровень клеточной пролиферации, адгезии, неоваскуляризации и деградации соединительнотканных структур при метастазировании опухолей [7–9]. Существенным прорывом в понимании функций РАС и ее роли в кацерогенезе явилось открытие и изучение рецепторов к ангиотензину II [10, 11]. Плейотропные функции ангиотензина II являются результатом передачи сигналов через два типа рецепторов – АТ1-R и АТ2-R. Считается, что большинство эффектов ангиотензина II реализуется через активацию АТ1-R, тогда как АТ2-R являются негативным регулятором сигнальных путей, зависимых от АТ1-R [12]. Установлено, что АТ2-R опосредуют вазодилатацию, процессы заживления, репарации и регенерации, антипролиферативное действие, дифференцировку и развитие эмбриональных тканей. Количество АТ2-R в тканях непостоянно: их число резко увеличивается при повреждении тканей и необходимости репаративных процессов [13].

Основным механизмом канцерогенного влияния РАС является ангиогенез, который опосредуется преимущественно через ангиотензин II–АТ1-R-зависимый сигналинг: ангиотензин II, образующийся под действием АПФ, активирует АТ1-R, которые стимулируют экспрессию нескольких проангиогенных факторов и факторов роста, включая фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), ангиопоэтин 2, фактор роста фибробластов (FGF-α) и фактор роста тромбоцитов (PDGF) [12, 14]. В противоположность этому селективная стимуляция АТ2-R вызывает торможение ангиогенеза [15]. Таким образом, в настоящее время доказано, что РАС относится к числу систем организма, вовлеченных в сложные пути канцерогенеза [16]. Исследования, касающиеся роли РАС в опухолевом прогрессировании, в настоящее время считаются одними из приоритетных [14].

Цель исследования: идентифицировать маркеры для прогнозирования агрессивных форм РПЖ.

Материалы и методы. Работы с биологическими материалами, полученными от пациентов, были проведены в соответствии с Национальным стандартом РФ «Надлежащая клиническая практика» (Good Clinical Practice; GCP) (ГОСТ Р 52379-2005) [17]. Для выполнения исследования получено разрешение Локального независимого этического комитета Ростовского государственного медицинского университета. Биологический материал собран с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности после получения информированного согласия пациентов на участие в исследовании.

На первом этапе пациенты, вошедшие в исследование, были обследованы с использованием клинических и инструментальных методов с обязательной морфологической верификацией опухоли предстательной железы, включая определение степени злокачественности по Глисону [18]. Проводившаяся с целью гистологической верификации диагноза трансректальная мультифокальная пункционная биопсия выполнялась под контролем трансректальной ультрасонографии и обеспечивала получение от одного пациента до 18 образцов тканей из различных зон простаты. Гистологически все случаи РПЖ были охарактеризованы как аденокарцинома.

Выбор методики лучевой терапии и ее сочетания с антиандрогенными стратегиями осуществлялся с учетом данных обследования. При локализованном РПЖ с низкой вероятностью поражения лимфатических узлов, высокой степенью дифференцировки опухоли и уровне ПСА не более 20 нг/мл лучевую терапию проводили в режиме монотерапии. Зона облучения включала предстательную железу, парапростатическую клетчатку, семенные пузырьки и шейку мочевого пузыря. Была использована «бокс-методика» облучения с четырех фигурных полей с переднезадних и перпендикулярных боковых направлений. Размер полей не превышал 6–7х8–10 см.

С помощью многолепесткового коллиматора (МЛК) формировали фигурные поля в соответствии с данными компьютерной томографии (КТ) на протяжении всего объема облучаемой мишени. Разовая доза составила 2 Гр 5 раз в неделю, суммарная очаговая доза – 72–74 Гр.

При признаках опухолевой экстензии, увеличенных лимфатических узлах в малом тазу, низкой степени дифференцировки опухоли лучевому воздействию подвергались и регионарные лимфатические узлы. При этом зона облучения простиралась от уровня L5 до нижнего края седалищных костей.

В поперечном направлении она ограничивалась боковыми стенками таза.

Планирование объема облучения осуществляли индивидуально с учетом взаиморасположения опухоли и нормальных тканей на КТ-сканах. Обязательное условие – использование фигурных полей, формируемых с помощью МЛК (рис. 1).

Пациенты с местнораспространенным РПЖ, подвергнутые наружной лучевой терапии, получали непрерывную адъювантную антиандрогенную депривацию агонистами лютеинизирующего гормона рилизинг-гормона (ЛГРГ). В качестве агониста ЛГРГ применяли гозерелин в дозе 3,6 мг с режимом введения каждые 4 нед подкожно в переднюю брюшную стенку. Гормональная терапия проводилась в течение всего периода мониторинга и далее не протяжении не менее 24 мес после начала наружной лучевой терапии. Двадцать процентов больных были подвергнуты билатеральной орхидэктомии.

Через 1, 6, 12 и 18 мес после завершения неоадъювантной таргетной терапии проводили мониторинг уровня ПСА в сыворотке крови. Согласно рекомендациям Американского общества терапевтической радиологии и онкологии (American Society for Therapeutic Radiology and Oncology) критерием биохимического прогрессирования после наружной лучевой терапии являются 3 последовательных повышения уровня ПСА (ПСА ≥2 нг/мл относительно надир уровня ПСА) независимо от его значения [19, 20].

На основе данных ПСА-мониторинга ретроспективно стратифицировали группы пациентов: с безрецидивным течением (1-я группа) и с развитием биохимического рецидива и клиническими признаками рецидива (2-я группа).

Для идентификации ассоциированных с прогрессированием РПЖ показателей – потенциальных маркеров клинически агрессивных форм РПЖ определяли экспрессию АТ2-R в ткани предстательной железы. Для иммуногистохимического исследования использован материал полифокальных пункционных биопсий и антитела Angiotensin II Type 2 Receptor (AT2), rabbitpolyclonal, 1:100 («Abcam»). В работе применены системы визуализации, промывочные и демаскировочные растворы производства «Dako» (Германия). Постановка иммуногистохимических реакций, интерпретация полученных результатов осуществлены в соответствии с общепринятыми правилами [21]. Экспрессию АТ2-R оценивали, подсчитывая долю иммунопозитивных клеток от общего числа опухолевых клеток в поле зрения микроскопа при увеличении в 40 раз.

Исследован материал пункционных биопсий простаты 20 мужчин с РПЖ, которым проводилась гормонолучевая терапия (ГЛТ). Первую группу составили 10 мужчин с РПЖ (средний возраст – 62,2±1,4 года, ПСА – 28,8±0,5 нг/мл) с развитием биохимического рецидива и клиническими признаками рецидива. Вторую группу составили 10 мужчин с местнораспространенным РПЖ (средний возраст – 64,7±2,4 года, ПСА –21,8±14,2 нг/мл) с безрецидивным течением. В 1-й группе у 7 пациентов диагностирована стадия Т3аN0, у 2 – Т3bN1, у 1 – Т4N1, во 2-й группе заболевание 8 мужчин соответствовало стадии Т3аN0, 2 – pТ3aN0M1. Группу сравнения составили 10 пациентов с доброкачественной гиперплазией предстательной железы (ДГПЖ).

Для расчетов использовали статистический пакет программ, XLSTAT, версия 7.5.2. для Macintosh. Математическую модель предсказания биохимического прогрессировмания в зависимости от значения АТ2-R строили c использованием бинарного логистического регресса. В качестве зависимой бинарной переменной использовали данные о биохимическом рецидиве: есть/нет.

Результаты. Только через 6 мес после завершения неоадъювантной таргетной терапии на основе ПСА-мониторинга удалось дискриминировать группу пациентов с развитием биохимического рецидива (в соответствии с рис. 2). Формирование группы пациентов с прогрессированием заболевания было завершено через полтора года после ГЛТ.

Ранее нами показано, что в ткани предстательной железы эффекторное действие калликреин-кининовой и ренин-ангиотензиновой систем при злокачественной и доброкачественной трансформации простаты реализуется через разные типы рецепторов: брадикининовых и ангиотензиновых [9, 22]. Действие ангиотензина II осуществляется по меньшей мере через два различных типа рецепторов – АТ1-R и АТ2-R. В литературе имеются немногочисленные и довольно противоречивые данные о функционировании этих рецепторов в предстательной железе в норме и патологии [10, 23].

Установлено, что экспрессия АТ2-R наблюдается как в ядрах эпителиальных клеток при ДГПЖ, так и в опухолевых клетках при РПЖ (рис. 3).

Однако характер экспрессии при этих заболеваниях различен. При ДГПЖ экспрессия АТ2-R во всех случаях максимальная, доля окрашенных клеток – 1 (или 100%). Вероятно, АТ2-R обладает протективной ролью в отношении развития РПЖ, однако конкретный биологический механизм данного феномена еще не изучен.

При РПЖ в ряде случаев доля окрашенных анти-АТ2-R-антителами клеток снижена. Определено, что фактором риска развития биохимического рецидива является снижение доли АТ2-R до 0,7 и менее (критерий χ2=29,56, р<0,01). Таким образом, при значениях АT2-R менее 0,7 вероятность возникновения биохимического рецидива определяется как высокая.

Так как в результате математического анализа было получено подтверждение значимости показателя АТ2-R в отношении развития биохимического рецидива, была построена математическая модель для определения вероятности (P) развития биохимического рецидива (есть/нет) для каждого пациента. Вероятность биохимического рецидива оценивали по формуле: Р=1/1+е-у, где Р – вероятность развития биохимического рецидива, e – основание натуральных логарифмов, Y – формула простого линейного регресса. В нашем случае уравнение логистического регресса имеет вид: Y = 6,31–8,494xAT2-R, где АТ2-R – доля клеток с экспрессией АТ2-R, выявленной иммуногистохимически. Графически данное уравнение представлено на рис. 4.

Для анализа практической ценности модели была использована ROC-кривая (Receiver Operator Characteristic; рис. 5).

Статистически значимые результаты теста Вальда, высокий R2 (R2=0,754), площадь под кривой (AUC=0,929) свидетельствуют о том, что данная модель обладает высокой прогностической ценностью и достоверно отражает вероятность биохимического рецидива в зависимости от значения АТ2-R. Чувствительность теста составляет 87,5%, специфичность – 85,71%.

Эффективность прогностического теста подтверждается также клиническими примерами его применения.

Клинический пример 1. Больной М. 64 лет. Диагностирована аденокарцинома простаты Т3аN1M0. По результатам иммуногистохимического анализа установлено, что доля АТ2-R равна 0,9 (т.е. окрашивание есть в 90% опухолевых клеток). Тогда у=6,31-8,494*0,9=-1,3346. Следовательно, Р=1/1+e1,3346. Е-основание натурального логарифма равно 2,71. e1,3346=3,76. Уравнение имеет вид – Р=1/1+3,76=1/4,76=0,2101. Следовательно, вероятность развития биохимического рецидива низкая и составляет 21,01%.

Клинический пример 2. Пациент К. 67 лет с аденокарциномой простаты Т3bN1M1. По результатам иммуногистохимического анализа доля АТ2-R равна 0,3. У=6,31-8,494*0,3=3,76. e-3,76=0,02355 Р=1/1+0,02355=0,9769, или 97,69%. Вероятность развития биохимического рецидива высока и составляет 97,69%.

Обсуждение. Выявление белков, ассоциированных с агрессивными формами РПЖ, позволяет получать новые данные о молекулярных механизмах канцерогенеза на разных этапах злокачественной трансформации и опухолевого прогрессирования.

Опухолевое прогрессирование сопровождается повышенной экспрессией таких компонентов РАС, как АПФ, ангиотензин II и его рецепторы. Ангиотензинпревращающий фермент и другие компоненты РАС экспрессируются всеми типами клеток, находящимися в микроокружении опухоли, в том числе эндотелиальными клетками, моноцитами, макрофагами, дендритными клетками, фибробластами и Т-клетками [24].

Нами показано, что снижение экспрессии АТ2-R в ткани простаты до начала ГЛТ имеет место у пациентов с последующим развитием биохимического рецидива, следовательно, дефицит АТ2-R ассоциирован с клинически агрессивными формами РПЖ. Это факт позволяет предполагать, что рецепторы данного типа обладают протективными свойствами при рецидиве РПЖ.

Ангиотензин II активирует рецепторы AT1-R, которые стимулируют в клетках экспрессию нескольких проангиогенных веществ и факторов роста, включая VEGF – важный регулятор ангиогенеза, который стимулирует в клетках процессы пролиферации и дифференцировки, ангиопоэтин 2, FGF-α и PDGF [25]. VEGF-сигналинг, индуцируемый AT1-R, является одним из ключевых регуляторов роста опухоли и опухолевого ангиогенеза при РПЖ [26]. Таким образом, в опухолевых и окружающих опухоль клетках ангиотензин II-AT1-R-сигналинг направлен на ускорение процесса пролиферации и перехода к злокачественности, а также вовлечен в модулирование ангиогенеза, который рассматривается в качестве одного из основных механизмов проопухолевого влияния РАС.

Рецепторы АТ2-R являются негативными регуляторами сигнальных путей, зависимых от АТ1-R. Через АТ2-R предположительно запускаются процессы апоптоза в клетках РПЖ посредством активации генов, рецепторов инициации апоптоза – TRAIL-R2 (TNF-relatedapoptosis-inducingligand), гена репарации ДНК-Gadd45a (Growth Arrestand DNA Damage) и активатора апоптоза HRK (HARAKIRI) [27, 28]. Если данное предположение верное, АТ2-R возможно будет использовать в разработке новых терапевтических подходов к лечению РПЖ. Обсуждается вопрос о применении препаратов, тормозящих РАС, для терапии рака. Ретроспективные клинические исследования показывают, что долгосрочное использование ингибиторов АПФ и блокаторов AT1-R может замедлять опухолевое прогрессирование [10].

Ранее нами установлено, что развитие рецидива РПЖ ассоциировано с увеличением активности АПФ, которая начинает расти раньше, чем выявляют развитие биохимического рецидива [29]. Необходимо отметить, что рост активности АПФ на ранних этапах развития рецидива РПЖ приводит к накоплению пептидного регулятора канцерогенеза – ангиотензина II, при этом лимитирующим фактором развития агрессивных форм РПЖ является наличие рецепторов к ангиотензину II. Мы предполагаем, что повышение активности АПФ на фоне снижения экспрессии АТ2-R является маркером, позволяющим прогнозировать ухудшение клинического исхода заболевания.

Этот вывод подтверждается также полученными нами данными об экспрессии рецепторов АТ2-R в ядрах эпителиальных клеток при ДГПЖ, простатической интраэпителиальной неоплазии (ПИН) и опухолевых клеток при РПЖ [9, 22]. При этом отмечена обратная пропорциональная зависимость между индексом Глисона и уровнем экспрессии АТ2-R: в низкодифференцированных РПЖ экспрессия АТ2-R, как правило, снижается [9].

Таким образом, анализ экспрессии АТ2-R в ткани простаты больных РПЖ до начала лечения позволяет выделить пациентов с высоким риском развития рецидива заболевания после ГЛТ и выбрать в отношении них оптимальную терапевтическую стратегию. При использовании модели предсказания биохимического прогрессирования после ГЛТ в зависимости от значения АТ2-R в ткани простаты чувствительность теста составляет 87,5% (p<0,01), специфичность – 85,71% (p<0,01).

Заключение. Использование идентифицированных прогностических маркеров рецидива РПЖ после ГЛТ позволяет на ранних этапах лечения выделить пациентов с высоким риском развития рецидива. Необходимо отметить, что низкая экспрессия АТ2-R в ткани простаты ассоциируется с высоким риском развития рецидива заболевания задолго до биохимического рецидива, что позволяет рассматривать АТ2-R как перспективный прогностический маркер биохимического рецидива РПЖ после ГЛТ. Ренин-ангиотензиновая система организма при РПЖ может рассматриваться как новая терапевтическая «мишень» для таргетной терапии.

Выявление белков, ассоциированных с развитием биохимического рецидива при ГЛТ, позволит разработать новые подходы к исследованию молекулярных механизмов инициации и прогрессиования РПЖ, что станет научной основой для создания аналитических систем с целью идентификации клинически агрессивных форм РПЖ.

В статье представлены результаты работ, выполненных при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации в рамках Соглашения о предоставлении субсидии № 14.607.21.0099, уникальный идентификатор прикладных научных исследований и экспериментальных разработок (проекта) RFMEFI60714X0099, ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014–2020 годы».