Введение. Важным фактором, влияющим на фертильность мужчины и здоровье его детей, является целостность ДНК в сперматозоидах. Нарушения в генетическом материале сперматозоидов встречаются у мужчин довольно часто. Они включают хромосомные мутации (делеции и анеуплоидию), эпигенетическую модификацию ДНК или гистонов, генные или точечные мутации, окисление нуклеотидных оснований и фрагментацию ДНК [1]. Целостность ДНК в сперматозоидах может нарушаться при дифференцировке мужских гамет при переходе от нуклеосомной организации хроматина к протаминовой укладке, что приводит к возникновению разрывов ДНК, часть из которых остается нерепарированной в зрелых сперматозоидах [2]. Фрагментация ДНК в дифференцирующихся половых клетках семенников может быть частью апоптотического процесса, т.е. фрагментированная ДНК в эякуляторных сперматозоидах может стать результатом незавершенного процесса апоптоза [1–3]. Еще одна возможная причина нарушения целостности ДНК в сперматозоидах – это оксидативный стресс, обусловленный избыточной продукцией свободных радикалов. Оксидативный стресс некоторыми авторами рассматривается как главный механизм, приводящий к появлению в эякуляте сперматозоидов с фрагментированной ДНК [3–5]. При некоторых патологических состояниях, связанных с воспалением, масса незрелых половых клеток и лейкоцитов попадает в эякулят, где служит основным источником свободных радикалов, усиливая процесс фрагментации ДНК в зрелых сперматозоидах [6, 7].

Целостность ДНК сперматозоидов необходима для передачи генетической информации, успешной беременности и обеспечения хорошего здоровья будущего поколения. Обнаружен ряд этиологических факторов, ассоциированных с фрагментацией ДНК и ослаблением целостности хроматина в сперматозоидах. К ним относятся курение, радиация, химиотерапия, загрязнение окружающей среды, а также патофизиологические состояния – лейкоцитоспермия, варикоцеле, рак семенников [3, 8–12]. Интересно отметить, что яйцеклетка способна в некоторой степени репарировать повреждения ДНК сперматозоидов, но если такие повреждения существенны, потенциала яйцеклетки может быть недостаточно для обеспечения нормального развития эмбриона [9].

Анализ фрагментации ДНК сперматозоидов впервые начали применять около 30 лет назад [13]. Стимулом к развитию данной методологии стал поиск причин мужского бесплодия, лежащего за пределами, объясняемыми параметрами спермограммы. Другим важным фактором было все более широкое использование вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), где для повышения шансов беременности потребовались дополнительные предикторы мужской фертильности, а успешность оплодотворения считалась важным критерием оценки ВРТ. Поиск оптимальных предикторов мужской фертильности способствовал развитию нескольких методов оценки целостности ДНК сперматозоидов, однако наибольшее распространение получил метод структурной оценки хроматина сперматозоидов – SCSA (sperm chromatin structure assay) – из-за небольшой индивидуальной вариации и относительного постоянства во времени индекса фрагментации сперматозоидов [1, 3, 13].

Простатит и варикоцеле относятся к наиболее часто встречающимся приобретенным урологическим заболеваниям. Простатит чаще всего развивается в хронической форме на протяжении нескольких лет. Основная причина болезни состоит в формировании в железе инфекционного очага, но нередко встречается простатит неинфекционного характера. Распространенность хронического простатита составляет 10–15% в общей популяции мужчин в возрасте от 20 до 50 лет, причем у молодых мужчин больше распространен асимптоматический инфекционный простатит [14, 15]. У трети больных простатит бывает осложнен везикулитом, эпидидимитом и орхитом [16]. Риск развития простатита увеличивается с возрастом. Наряду с ожирением, метаболическим синдромом, сахарным диабетом 2 типа, эректильной дисфункцией и андрогенным дефицитом некоторые авторы относят хронический простатит к возраст-ассоциированным заболеваниям, между которыми имеются патогенетические связи [16, 17].

Варикоцеле проявляется расширением вен лозовидного сплетения яичка как следствие органной венной почечной гипертензии и первичной недостаточности стенки семенниковой вены. Чаще всего варикоцеле локализуется на левой стороне. Распространенность клинического варикоцеле у мужчин составляет около 15%, наиболее часто заболевание встречается в возрасте от 15 до 25 лет, тогда как в преклонном возрасте диагностируется относительно редко [11, 12, 18]. Развитие варикоцеле зависит от многих факторов, включая возраст, характер труда и даже этническую принадлежность. Часто варикоцеле развивается у мальчиков в период полового созревания одновременно с увеличением яичек [19]. Варикоцеле встречается среди лиц различных профессий, но чаще болеют работники физического труда. Длительный застой венозной крови ведет к гипоксии, развитию склеротических изменений и повреждению гематотестикулярного барьера в семенниках, усилению интенсивности перекисного окисления липидов [19].

Имеется довольно много сообщений о негативном влиянии простатита и варикоцеле на мужскую фертильность. Установлено, что варикоцеле может являться причиной первичного и вторичного бесплодия и наблюдается у 35–50% пациентов с бесплодием [12, 18]. Взаимосвязь между простатитом и бесплодием у мужчин остается неясной, однако сопровождающие это заболевание лейкоцитоспермия, повышенный уровень реактивных форм кислорода в семенной жидкости, иммунологические отклонения должны рассматриваться как кофакторы в развитии бесплодия у пациентов с простатитом [20, 21]. Как простатит, так и варикоцеле могут сопровождаться ухудшением параметров спермограммы, хотя имеющиеся данные часто противоречивы [11, 19, 20, 22, 23]. Вредные привычки, например курение, пациентов с варикоцеле ухудшают показатели спермограммы, повышают активность перекисного окисления липидов и сопровождаются изменениями протеома семенной жидкости [24]. Клинические исследования демонстрируют, что после варикоцелэктомии у пациентов улучшаются параметры спермограммы, а в случае бесплодия повышается успешность ВРТ [18, 25]. Таким образом, описанные андрологические заболевания могут оказывать существенное влияние на мужскую фертильность, однако требуются дополнительные исследования, проясняющие и уточняющие их патофизиологические и эпидемиологические аспекты.

Помимо ухудшения параметров спермограммы и других репродуктивных нарушений негативные эффекты варикоцеле и простатита на мужскую фертильность могут включать нарушение целостности ДНК сперматозоидов [10, 12, 25, 26]. В дополнение к стандартным параметрам спермограммы оценка степени повреждения ДНК в сперматозоидах, несомненно, дает дополнительную диагностическую и прогностическую информацию о репродуктивном потенциале мужчины. Тем не менее необходимы исследования, устанавливающие референтные значения уровня повреждения ДНК сперматозоидов в норме и при различных патологических состояниях, чтобы обосновать необходимость использования различных методов оценки целостности ДНК сперматозоидов в рутинной лабораторной диагностике для диагностических и прогностических целей.

Цель настоящего исследования состояла в оценке уровня фрагментации ДНК сперматозоидов у мужчин, страдающих варикоцеле и хроническим простатитом, методом SCSA с использованием проточной цитометрии и основных показателей фертильности спермы (концентрация, подвижность и морфология сперматозоидов), а также взаимосвязи между ними.

Материалы и методы. Исследование проведено на 53 мужчинах-добровольцах активного репродуктивного возраста, которых рекрутировали по объявлению в сети Интернета и после публичных лекций по мужскому репродуктивному здоровью. Условия для включения добровольцев в группу испытуемых были следующими: они должны были постоянно проживать в Новосибирске, на момент исследования быть клинически здоровыми, не проходить медикаментозного лечения, воздерживаться от половых контактов и употребления алкоголя в течение 2–3 суток до начала обследования. Каждый мужчина был ознакомлен с методами и целями исследования, после чего дал свое письменное согласие на обследование. Все испытуемые проходили физикальный осмотр врачом-андрологом, анкетирование, антропометрию (рост и масса тела). Физикальное обследование включило оценку состояния наружных половых органов, измерение битестикулярного объема (БТО) орхидометром Прадера, пальпацию и ректальное исследование простаты, включая оценку размера, выраженность срединной бороздки, однородности, консистенции, болезненности. Из исследования исключили мужчин с азооспермией, крипторхизмом, гипоспадией, кистами придатков и семенников. Анкета включила демографические и этнические характеристики, социальный статус, профессию. Индекс массы тела (ИМТ) рассчитан по формуле: масса тела (кг)/рост (м2). Возраст испытуемых составил от 20 до 45 лет (средний возраст – 30,5 ± 0,9 года). Почти все обследованные принадлежали к славянской этнической группе.

В результате беседы с андрологом, сбора жалоб и анамнеза, а также физикального осмотра у 31 мужчины были клинически диагностированы простатит или варикоцеле, в некоторых случаях с жалобами на бесплодие. В группу мужчин с простатитом вошли 9 человек, имеющих хроническую форму заболевания, а в группу с варикоцеле – 22 мужчины, имеющих, как правило, варикоцеле слева различных стадий. У двух мужчин были диагностированы одновременно простатит и варикоцеле, одного из них включили в группу с варикоцеле из-за слабых клинических проявлений конгестивного простатита, а другого – в группу с простатитом из-за сочетанного проявления простатита и воспаления придатков.

Контрольная группа была представлена 22 мужчинами без урогенитальных заболеваний в анамнезе, не имеющих жалоб на репродуктивное здоровье, с нормальными показателями спермограммы (концентрация, подвижность и морфология сперматозоидов), согласно критериям ВОЗ [27].

Сбор и анализ эякулята проведены в соответствии с рекомендациями ВОЗ [27]. Эякулят получали путем мастурбации в разовые стерильные пластиковые контейнеры, контейнер с образцом выдерживали в термостате при 37°С в течение 1 ч для разжижения. Концентрацию сперматозоидов подсчитывали в камере Горяева визуально под световым микроскопом при увеличении 400 после окрашивания аликвоты эякулята трипановым синим при 4°С. Долю подвижных сперматозоидов категорий А (с прогрессивным прямолинейным движением более 25 мкм/с) и Б (со скоростью 2–25 мкм/с) оценивали с помощью спермоанализатора SFA-500-2 («Биола», Россия). Мазки эякулята окрашивали наборами Diff-Quik («Абрис+», Россия). Морфологию первых 200 сперматозоидов анализировали по строгим критериям Крюгера на микроскопе Carl Zeiss (Германия) при увеличении 1000 под иммерсией, как описано ранее [28].

В сыворотке крови определен уровень лютеинизирующего (ЛГ) и фолликулостимулирующего (ФСГ) гормонов, тестостерона, эстрадиола, ингибина В иммуноферментным методом с использованием наборов реактивов: гонадотропин ИФА-ФСГ, гонадотропин ИФА-ЛГ, стероид ИФА-тестостерон-01 («Алкор Био», Санкт-Петербург), эстрадиол-ИФА («Хема Медика», Москва), Inhibin B Gen II ELISA («Beckman Coulter», Inc, США).

Часть эякулята центрифугировали, семенную жидкость удаляли, к осадку сперматозоидов добавляли раствор RNA-later для консервации ДНК и РНК сперматозоидов («Applied Biosystems» Inc., США). Суспензию сперматозоидов помещали в холодильник на ночь, после чего замораживали и хранили при -40°С до проведения анализа на фрагментацию ДНК. Для оценки фрагментации ДНК в сперматозоидах был применен метод SCSA, предложенный [29] с некоторыми модификациями [30]. Принцип метода заключается в способности красителя акридинового оранжевого флюоресцировать зеленым цветом при связывании с двухцепочечной (нативной) ДНК и флюоресцировать красным при связывании с одноцепочечной (денатурированной) ДНК. После размораживания каждый образец разводили в TNE-буфере (0,01 М Трис, 1 мМ ЭДТА, 0,15 М NaCl, pH 7,4) до концентрации сперматозоидов 1 млн в 1 мл. К 100 мкл разведенных в буфере сперматозоидов добавляли 200 мкл кислотного буфера (0,1%-ный Тритон-X-100, 0,15 М NaCl, 0,08 н. HCl, pH 1,2). После инкубации в течение 30 с к суспензии сперматозоидов добавили 600 мкл красящего раствора, содержащего 6 мг/л акридинового оранжевого в растворе: 0,2 М Na2HPO4, 1 мМ ЭДТА (дисодиум), 0,15 M NaCl, 0,1 M лимонной кислоты (pH 6). Подсчет количества сперматозоидов с красной и зеленой флюоресценцией проводили на флюоресцентном цитометре Guava Easy Cyte Mini («Guava», США). Каждый образец оценивали трижды, используя 5000 клеток. Индекс фрагментации ДНК (ИФД) рассчитывали по формуле: количество клеток с красной флюоресценцией х 100%/суммарное количество клеток с красной и зеленой флюоресценцией. Таким образом, ИФД означает долю дефектных сперматозоидов, имеющих разрывы цепи ДНК. Следует подчеркнуть, что клетки эякулята, имеющие значительные отличия от нормальных зрелых сперматозоидов по размерам и рыхлости ядра, отбраковывались в ходе анализа, поскольку не попадали в настраиваемое поле зрения прибора.

Три группы мужчин (с варикоцеле, простатитом и контроль) сравнивали по ИФД, антропометрическим, гормональным и сперматогенным показателям с использованием однофакторного дисперсионного анализа (пакет компьютерных программ STATISTICA, версия 6.0). Для всех исследуемых показателей рассчитывали среднюю арифметическую и ошибку средней (Mean±SE), медиану (Median), 25-й и 75-й квартили. Для выявления взаимосвязи между ИФД и показателями спермограммы рассчитывали коэффициенты корреляции по Пирсону. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимали равным 0,05.

Результаты. Рост, масса тела и индекс массы тела, возраст начала половой жизни и сексуальная активность мужчин трех групп не различались. Возраст мужчин с простатитом был достоверно выше, чем в контроле, что отражает общую тенденцию возрастного проявления этого заболевания (табл. 1). Установлено, что БТО был достоверно ниже у мужчин с простатитом по сравнению с контролем (табл. 1).

Следует отметить, что доля женатых мужчин в группах составила от 73 до 89%, однако имели детей лишь от 18 до 33% испытуемых (p>0,05).

Выявлено достоверное снижение некоторых параметров спермограммы при андрологических заболеваниях (табл. 2). Концентрация сперматозоидов была достоверно ниже в группе лиц с простатитом по сравнению с контролем (p<0,01), аналогичная тенденция просматривалась в группе с варикоцеле (табл. 2). Особенно выраженные изменения касались подвижности сперматозоидов: доля подвижных сперматозоидов у больных варикоцеле снижалась в 1,6, а у больных простатитом – в 2,8 раза по отношению к контролю (p<0,001).

Достоверных различий между группами в концентрации основных репродуктивных гормонов в сыворотке крови обнаружено не было (табл. 2). Кроме того, не установлено достоверных коэффициентов корреляции между гормональными и сперматогенными показателями (данные не представлены). Таким образом, варикоцеле и простатит не сопровождаются изменением функционирования гипофизарно-семенниковой эндокринной оси, и, поскольку все гормональные показатели были в пределах нормы, снижение качества спермы при варикоцеле или простатите не опосредуются изменениями гормонального статуса.

Выявлено, что пациенты с варикоцеле и простатитом достоверно отличались от контроля более высокими, в 1,8–1,9 раза, показателями ИФД (p<0,005, табл. 2). Данные проведенного корреляционного анализа показали, что имеется статистически достоверная связь между ИФД сперматозоидов и концентрацией сперматозоидов или долей подвижных сперматозоидов, хотя с другими показателями спермограммы достоверных линейных связей не установлено (табл. 3).

Обсуждение. В настоящей работе у мужчин репродуктивного возраста, страдающих варикоцеле и простатитом, установлено снижение некоторых параметров спермограммы по сравнению со здоровыми мужчинами, что в конечном счете уменьшает фертильную способность сперматозоидов и повышает риск субфертильности в этих группах. Наши данные подтверждают полученные ранее факты, свидетельствующие об ухудшении параметров спермограммы у мужчин с варикоцеле или простатитом [11, 20, 22]. Более того, мужчины с варикоцеле и простатитом характеризовались более высоким ИФД сперматозоидов по сравнению со здоровыми мужчинами, что может служить одним из патогенетических механизмов сниженной фертильности или бесплодия, обусловленного рассматриваемыми заболеваниями. Полученные данные дополняют имеющиеся факты, свидетельствующие о нарушениях целостности ДНК сперматозоидов у больных варикоцеле [8, 10, 11].

В настоящее время у исследователей нет определенности в вопросе о взаимосвязи ИФД сперматозоидов с обычными показателями спермограммы (концентрация, подвижность и морфология сперматозоидов) [5]. В нашем исследовании установлена статистически достоверная линейная отрицательная взаимосвязь между ИФД сперматозоидов и концентрацией или долей подвижных сперматозоидов. Кроме того, в группах с варикоцеле и простатитом подвижность сперматозоидов была ниже, а ИФД – выше по сравнению с контролем, хотя не все испытуемые этих групп характеризовались патоспермией. При исследовании повреждений ДНК методом SCSA у мужчин из бесплодных пар отмечали, что в группе мужчин с нормальными параметрами спермограммы только 15% имели ИФД больше 20%, а в группе с патоспермией таких мужчин было уже 35% [31]. Отрицательные достоверные коэффициенты корреляции у пациентов, обратившихся в клинику по поводу бесплодия, установлены между концентрацией (r=-0,207) и долей подвижных сперматозоидов (r=-0,624) и ИФД, оцененному по методу SCSA [32]. Таким образом, между параметрами спермограммы и уровнем фрагментации ДНК, по-видимому, существует взаимосвязь, которая не всегда имеет линейный характер, учитывая многофакторную природу формирования нарушений целостности ДНК [1, 5]. Возвращаясь к нашим данным, можно предположить, что ухудшение качества спермы у мужчин с варикоцеле и простатитом, а в конечном итоге – повышение риска субфертильности могут быть частично обусловлены фрагментацией ДНК сперматозоидов. Основываясь на результатах данной работы и работ других авторов, можно говорить о самостоятельной прогностической и диагностической ценности анализа фрагментации ДНК сперматозоидов, который может с успехом дополнять спермограмму, однако не заменяя ее.

До сих пор не существует клинически обоснованных пороговых значений ИФД сперматозоидов, что ограничивает применение метода SCSA в клинической диагностике [7, 33]. Неопределенность в референтных значениях ИФД сперматозоидов в значительной степени обусловлена применением различных вариаций метода, отсутствием стандартизированных протоколов пробоподготовки, использованием различных репродуктивных параметров в качестве оценки потенциала мужской фертильности, а также недостаточной изученностью факторов, влияющих на целостность ДНК в сперматозоидах [1]. В циклах вспомогательных репродуктивных технологий обычно оценивается влияние фрагментации ДНК сперматозоидов на долю успешных зачатий, жизнеспособность эмбрионов или плодов. Интересные данные получены относительно частоты наступления беременности после оплодотворения in vitro (IVF) и интрацитоплазматической инъекции сперматозоидов (ICSI) [34]. Оказалось, что наступление беременности наблюдалось при пороговых значениях ИФД 15,4±4,6%, но при ИФД 31,1±3,2% беременность уже не наступала. В обеих группах мужчин стандартные параметры спермограммы достоверно не различались. В других работах показано, что в общей популяции мужчин шансы спонтанной беременности были высокими и постоянными при ИФД в интервале 0–20%, но уменьшались, когда ИФД был больше 20%, а при ИФД, равном 30–40%, шансы наступления спонтанной беременности уменьшались до нуля [35]. При использовании метода SCSA для оценки фрагментации ДНК сперматозоидов некоторые авторы для улучшения эффективности ВРТ рекомендуют придерживаться в качестве референтных значений нормы ИФД до 15%, значения ИФД в интервале от 15 до 27 предлагают рассматривать как пограничные, а к высоким значениям относить ИФД более 27% [30]. В нашем исследовании среднее значение ИФД в группе контроля составило 15,02±0,94%, однако определенно судить о связи значений ИФД с демографической фертильностью обследованных мужчин не представлялось возможным, поскольку большинство из них не имели детей.

В литературе есть сообщения о том, что на целостность ДНК сперматозоидов могут оказывать влияние хранение, транспортировка и подготовка образцов сперматозоидов. Например, установлено, что у фертильных доноров значения ИФД, полученные методом SCD (дисперсия хроматина в сперматозоидах, оцениваемая с помощью флуоресцентной микроскопии), варьировались от 8 до 28% сразу после размораживания осадков сперматозоидов. Последующая инкубация при 37°С увеличивала значения ИФД в зависимости от ее длительности в среднем на 8,3% за 1 ч в течение первых 4 часов [36]. В других экспериментах оценивалась степень целостности ДНК сперматозоидов в свежих образцах эякулята, которые подвергались центрифугированию в градиенте плотности или обогащению методом всплытия и последующей инкубации при комнатной температуре либо при 37°С [32]. Целостность ДНК в сперматозоидах оценивали методом SCSA. ИФД сперматозоидов в свежем эякуляте составлял 15,8±9,6%, центрифугирование в градиенте плотности увеличивало ИФД до 29,7±20,4%. Методом всплытия удалось значительно понизить ИФД до 8,9±6,7%. Инкубация сперматозоидов при 37°С в течение 3 ч повышала фрагментацию ДНК сперматозоидов, но значительное повышение наблюдалось после 24 ч инкубации, в то время как при комнатной температуре ИФД оставался стабильным, по крайней мере в течение 5 ч. Таким образом, данные литературы, касающиеся процедур обработки и хранения эякулята, свидетельствуют о необходимости дополнительной экспериментальной проработки и стандартизации протокола хранения и подготовки эякулята к определению ИФД методом SCSA. Кроме того, можно заключить, что используемая в нашей работе обработка эякулята, проводимая в соответствии с рекомендациями ВОЗ [27], может несколько завышать значения ИФД за счет неспецифической фрагментации ДНК, обусловленной инкубацией эякулята в течение 1 ч при 37°С, необходимой для его разжижения, а также процедурой заморозки–оттаивания.

Заключение. Структурный анализ хроматина сперматозоидов методом SCSA обеспечивает получение полезной информации по фрагментации ДНК эякуляторных сперматозоидов. У мужчин репродуктивного возраста, страдающих простатитом, наблюдалось снижение концентрации и доли подвижных сперматозоидов в эякуляте, а при варикоцеле – снижение доли подвижных сперматозоидов. В то же время в обеих группах мужчин ИФД сперматозоидов был достоверно выше, чем в контроле, что указывает на вовлечение фрагментации ДНК сперматозоидов в патогенез этих заболеваний. Требуются дополнительные исследования для стандартизации метода SCSA и обоснования референтных значений ИФД, тем не менее оценка фрагментации ДНК может быть использована в лабораторной диагностике для прогноза фертильности мужчин детородного возраста, страдающих заболеваниями, приводящими к бесплодию.

Работа выполнена при финансовой поддержке Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки – медицине» (Проект ФНМ-2012-28).