Способы моделирования острого пиелонефрита. Методики экспериментального моделирования острого пиелонефрита (ОП) многообразны. Существует несколько принципиально различающихся методик, обеспечивающих точное воспроизведение патологического процесса [1]. В отечественной и зарубежной литературе подробно описана методика «восходящего» моделирования ОП. Инфекционный агент (инокулят) в объеме 0,4 мл (в большинстве случаев E. сoli в количестве 109 КОЕ)/мл) вводится по ангиокатетеру № 22 в мочевой пузырь. Затем катетер удаляют и накладывают на уретру зажим или закрывают наружное отверстие уретры на 4 ч, что обеспечивает необходимую рефлюксацию инфицированной мочи в лоханку почек и успешное воспроизведение ОП [2–4]. Таким образом, данная методика является моделью развития двустороннего рефлюксогенного ОП.

Другая модель ОП предполагает прямое введение инфекционного агента (0,1 мл культуры E. сoli в количестве 5х109 КОЕ/ мл) в верхний полюс почки после ее выделения лапаротомным доступом [5–7]. По сути эта модель, по мнению авторов, соответствует в клинике острому необструктивному воспалительному поражению почки.

В некоторых более ранних отечественных работах [8, 9] описана методика моделирования ОП путем введения возбудителя непосредственно в кровь животных. Для осуществления этого способа однократно внутривенно вводили 20–25%-ный раствор этанола, а через 8 ч также внутривенно 3 мл E. сoli в концентрации 108 КОЕ/мл. Недостатком методики является применение при моделировании ОП сильно действующего токсического вещества, что не соответствует клиническим условиям развития заболевания [10].

В середине 1970–1980-х гг. коллектив исследователей под руководством члена-корреспондента РАМН профессора Ю. А. Пытеля в результате экспериментальных исследований и клинических наблюдений установил тесную связь между нарушением гормонального баланса в организме и уродинамики верхних мочевых путей. Авторы разработали экспериментальную модель ОП, предусматривающую внутримышечное введение кроликам эстрогенов и прогестинов из расчета 2 мг/кг [11, 12].

В последние годы все чаще используется способ экспериментального моделирования ОП путем открытого лигирования мочеточника и последующего введения инокулюма в почечную лоханку [13–15]. Эта методика (по E. J. Giamarellos-Bourboulis, 2004) была применена нами ранее и описана [16]. После премедикации и анестезии животного через верхнесрединный абдоминальный разрез длиной 4 см вскрывают брюшную полость. Кишечник перемещают вправо (или влево). Левый (или правый) мочеточник после визуализации на 2,5 см дистальнее лоханки окружают нитью 3/0 и подтягивают к передней брюшной стенке. Оба конца нити проводят через переднюю брюшную стенку наружу и завязывают на коже, тем самым вызывая частичную обструкцию. Для создания полной обструкции мочеточника под него заводят нить 3/0 и перевязывают его с последующим введением бактериального патогена в концентрации 105 КОЕ/мл в 1 мл физиологического раствора через иглу 26 G в почечную лоханку [17].

Однако оперативный доступ к органам мочевой системы у экспериментальных животных – это не только средство формирования условий для развития инфекционного процесса, но и операционная травма, что в свою очередь в некоторой мере искажает регистрируемые в эксперименте показатели за счет дополнительного стресса и тем самым снижает чистоту эксперимента и достоверность полученных результатов. Учтя это, в работе [18] экспериментальное моделирование ОП было осуществлено оригинальным способом. Животным однократно интраперитонеально под легким эфирным наркозом вводили 400 мкл суточной культуры лактозонегативного штамма E. coli № 2899. Е. И. Самоделкин и соавт. [1] моделировали ОП двумя способами: в первом использовали ту же методику однократного интраперитонеального введения штамма микроорганизма, во втором ОП моделировали путем ректального введения урокультуры с последующим стрессовым (холодовой стресс) воздействием. Лабораторным животным однократно ректально вводили суточную бульонную культуру лактозонегативного штамма E. coli № 2899 в концентрации 109 КОЕ/мл в количестве 400 мкл.

На следующие сутки животных подвергали холодовому стрессу в течение 2 ч при температуре 0+2°C. Таким образом, эту модель ОП можно считать методикой воспроизводства двустороннего гематогенного ОП [19, 20].

В ходе анализа нами было изучено несколько работ [21, 22], в которых одномоментно использовали две методики моделирования ОП. Так, S. Zeidan и соавт. (2012) [21] воспроизводили в эксперименте ОП одномоментно на одном и том же животном путем интраперитонеального и чреспузырного введения инфекционного агента.

Уропатогены. В большинстве работ при экспериментальном моделировании ОП в качестве тестовой культуры используют различные штаммы E. сoli (АТСС 36; АТСС1677; ATCC 25922; АТСС 2899; CFT073 и др.) в разных концентрациях (101 – 109) и объемах (0,1 – 10 мл). Описан ряд других [1, 10, 13, 23, 24, 25] бактериальных патогенов, используемых в моделировании ОП на животных: P. aeruginosa, K. pneumoniаe, S. saprophyticus, C. trachomatis, U. urealyticum в концентрациях 105 КОЕ/мл и объеме 0,1–3,0 мл. За последние годы наша исследовательская группа провела сравнительное исследование по воспроизведению острого обструктивного пиелонефрита путем инфицирования лоханочной мочи анаэробными микроорганизмами: Peptococcus spp., Eubacterium spp., Propionibacterinum spp., Bacteroides spp. При этом было установлено, что все названные анаэробы вызывают острое воспаление лоханки, окололоханочных тканей и почечной паренхимы, подобное поражению, ранее описанному для E. coli. Оказалось, что Propionibacterinum spp. обусловливают меньшую тяжесть поражения, чем E. coli, а Peptococcus spp., Eubacterium spp. и Bacteroides spp. – более тяжелые, чем E. сoli, деструктивные воспалительные изменения в почке. Показано, что при микст-инфекции (E. coli+Peptococcus spp.) тяжелее всего повреждается почечная паренхима вследствие развития некрозов и абсцессов [26].

Методика анестезии при моделировании ОП. При всем многообразии моделей пиелонефрита методики анестезии тесно связаны с видовой принадлежностью экспериментального животного, что объясняется физиологическими особенностями животных различных видов и пород, возраста и пола, различиями в переносимости общей анестезии и чувствительностью к препаратам. В последнее время в зарубежной литературе появляются сообщения о применении кетамина для анестезии экспериментальных животных [7, 13, 27]. Например, при моделировании ОП на кроликах используют внутримышечное введение кетамина в дозе 25 мг/кг в сочетании с инъекцией 5 мг/кг ксилозина или же 20 мг седуксена. В отечественных работах описывают методику анестезии на кроликах путем внутримышечного введения золетила в дозе 15 мг/кг с последующим внутривенным введением в краевую вену уха 1%-ной водной эмульсии пропофола в дозе 5 мг/кг [26, 28]. В ряде работ анестезию на крысах и мышах проводят с помощью хлоралгидрата в дозе 300 мг/кг [4, 29]. Довольно широкое распространение в современной экспериментальной анестезиологии получил метод нейролептаналгезии, препараты для которой могут использоваться как в качестве премедикации, так и для поддержания общей анестезии у различных видов животных. Данная методика анестезии описана в экспериментальной модели пиелонефрита на мышах в работе [30], где животных вводили в наркоз путем премедикации фентанилом в дозе 0,08 мг/кг и дроперидолом в дозе 2,9 мг/кг. Диэтиловый эфир для анестезии экспериментальных животных в настоящее время используют не так часто из-за взрывоопасности и раздражения дыхательных путей [31, 32].

Виды животных при моделировании ОП. Бурное развитие медико-биологических исследований в XX и XXI вв. привело к тому, что в настоящее время в мире ежегодно используется более 100 млн экспериментальных животных. При моделировании ОП в большинстве случаев используют самцов новозеландских кроликов, что обусловлено высокой естественной чувствительностью к инфекциям, возможностью получения достаточных объемов крови для одномоментного проведения иммунологических, биохимических и серологических исследований, простотой повторного прижизненного забора мочи катетером в достаточном количестве для микробиологических и других лабораторных исследований, наличием кроличьих люминесцентных сывороток промышленного производства для идентификации E. coli в мазках – отпечатках внутренних органов животных [33]. Реже в качестве экспериментальных животных используют самок крыс рода Sprague–Dawley и Wistar и самок мышей линии BALB/с, что обусловлено возможностью выполнения острого эксперимента на значительном количестве животных и высокой естественной устойчивостью к инфекциям [15, 21, 27].

Цели моделирования ОП. Пиелонефрит – это инфекционное заболевание, которое характеризуется воспалительным повреждением почки и развитием поздних осложнений [34–39]. Большинство авторов в своих работах по экспериментальному моделированию ОП ставят следующие цели: изучение морфологических и морфометрических особенностей поражения почек, клинико-бактериологических особенностей течения пиелонефрита, механизмов развития окислительного стресса и гибели клеток эпителия почечных канальцев, механизмов сигнализации через Toll-подобные рецепторы и синтеза провоспалительных цитокинов; оценку межклеточных взаимодействий при развитии воспаления, результатов применения новых терапевтических агентов; приближение способа моделирования к клиническому течению заболевания, достижение стабильности воспроизведения модели и т.д. [10, 26, 40].

Методики контроля модели ОП. Исходя из поставленных целей исследования, авторы используют различные методики контроля течения пиелонефрита [6, 26, 41]:

• клиническую оценку течения заболевания (общесоматическое состояние животного с учетом двигательной активности, пищевого и питьевого поведения, реакции на внешние раздражители, сроки развития симптомов, тяжесть токсического синдрома);
• общелабораторные (уровень мочевины и креатинина сыворотки крови) и микробиологические (уровень бактериурии) показатели;
• гистопатологическое исследование, в ходе которого оценивают внутритканевую инфильтрацию воспалительных клеток, расширение канальцев, образование гиалинового цилиндра, интерстициальный фиброз;
• иммуногистохимическое исследование для выявления трансформирующего фактора роста β, который усиливает дифференцировку и снижает пролиферацию клеток, поддерживает незрелый фенотип тубулярных клеток, стимулирует синтез и ингибирует деградацию экстрацеллюлярного матрикса, стимулирует апоптоз, так как усиление его экспрессии приводит к нарушению нефрогенеза;
• оценку активности оксидантной/противооксидантной систем;
• изучение содержания плазменных воспалительных цитокинов и хемокинов;
• сцинтиграфию почек (выявление рубца, определение объема пострадавшего коркового вещества почки) и т.д.

Статистические исследования. В современной зарубежной и отечественной литературе для обработки полученных данных используют различные статистические методики: получение средних значений и среднеквадратичных ошибок, Т-критерий Стъюдента, а также коэффициент корреляции Спирмена и дискриминантный анализ. Анализ данных проводят с использованием программы SPSS. Гистопатологические и иммуногистохимические результаты оценивают с помощью непараметрического теста Крускала–Уоллиса с последующим U-тестом по методу Манна–Уитни. Проценты повреждения ткани сравнивают с помощью однофакторного дисперсионного анализа апостериорного теста Бонферрони [7, 26, 27].

Заключение. Таким образом, экспериментальное моделирование ОП позволяет вести поиск новых уропатогенов, изучать механизмы развития заболевания при различных способах попадания инфекционных агентов в почку и мочевую систему, особенности формирования хронизации воспалительного поражения почек. Полученные результаты расширяют представления о патогенезе инфекционно-воспалительных заболеваний почек и мочевыводящих путей и способов их терапевтической коррекции.